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  • 肝细胞生长因子与成纤维生长因子联合诱导人脐带间充质干细胞向肝样细胞的分化 免费阅读 下载全文
  • 背景:成纤维生长因子可促进间充质干细胞增殖、贴壁生长,但对其诱导间充质干细胞向肝细胞分化的实验报道为数不多。当肝细胞生长因子质量浓度达1μg/L时,可促进肝细胞有丝分裂,它是正常肝细胞最强的促有丝分裂剂。 目的:体外分离培养人脐带间充质干细胞,拟揭示其生物学特性及在细胞因子联合诱导下向肝样细胞分化的能力。 设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008—08/2009-04在暨南大学血研所完成。 材料:脐带取自健康足月胎儿,产妇对实验知情同意,由广州华侨医院提供。肝细胞生长因子、成纤维生长因子为美国Peprotech产品。 方法:Ⅳ型胶原酶消化+差速贴壁法分离培养人脐带间充质干细胞,取传至第3代细胞,进行细胞表面抗原分析、细胞周期测定,检测其成脂、成骨能力。取第5代细胞,调整细胞密度为5×10^9L^-1,分为2组:对照组用含体积分数为5%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养:诱导组在其基础上,添加20μg/L肝细胞生长因子、10μg/L成纤维生长因子联合诱导其向肝样细胞分化。 主要观察指标:人脐带间充质干细胞的生物学特性,人脐带间充质干细胞体外向肝样细胞的分化情况。 结果:成功从人脐带中分离并纯化得到间充质干细胞,第3代细胞92.2%处在G0/G1期:表达CD29,CD44,CD105,不表达造血细胞标志CD34,CD45.油红O染色后胞浆中呈现红色颗粒,碱性磷酸酶染色后细胞质呈黑色,具有成脂、成骨能力。经肝细胞生长因子、成纤维生长因子联合诱导10d后,RT-PCR及Western blot检测结果显示细胞表达肝细胞特异性抗原甲胎蛋白、白蛋白,对照组均呈阴性表达。 结论:人脐带中含有丰富的间充质干细胞,其具有较强的多向分化潜能,经肝细胞生长因子与成纤维生长因子联合诱导后,易向肝样细胞分化。
  • 碱性成纤维细胞生长因子对人前脂肪细胞增殖和分化的影响 免费阅读 下载全文
  • 背景:以前的观点认为碱性成纤维细胞生长因子通过促进移植脂肪内的血管再生来提高脂肪的存活率,但其对脂肪细胞的影响没有明确的定论。 目的:观察碱性成纤维细胞生长因子对人前脂肪细胞增殖和诱导分化的影响。 设计、时间及地点:细胞学体外培养,对比观察,于2006-03/2007-12在武警医学院完成。 材料:获取腹部吸脂术患者的脂肪组织标本10例,男1例,女9例,年龄21-45岁。 方法:通过分离、培养和自然纯化过程,获取人前脂肪细胞。实验随机分为碱性成纤维细胞生长因子组和对照组,对照组细胞单纯应用DMEM培养萆进行培养传代,碱性成纤维细胞生长因子组使用稀释质黾浓度为100ng/L的碱性成纤维细胞生长因子DMEM培养摹对细胞生长进行干预。 主要观察指标:①倒置相差显微镜观察培养后0,3,6,9,12,15d细胞形态,并进行细胞计数,测定细胞生长曲线。②应用油红O染色,观察细胞内脂肪聚集情况,酶联免疫检测仪上测定吸光度值。 结果:接种后第1~15天,可见梭形的前脂肪细胞分裂增殖,局部融合成细胞单层,部分细胞分化,细胞内脂滴聚集增多。已有细胞变为单泡细胞,接近发育成熟。碱性成纤维细胞生长因子组和对照组细胞形态无明显差异,但碱性成纤维细胞生长因子组细胞数比对照组细胞数多44%。油红O染色后人前脂肪细胞内逐渐出现脂滴,呈瞎红色,在培养后15d细胞内脂滴浓度达到顶峰。碱性成纤维细胞生长因子组吸光度值比对照组增加300%,差异具有曼著性意义(P〈0.05)。 结论:碱性成纤维细胞生长因子可以促进人前脂肪细胞的增殖及向脂肪细胞分化。
  • 食蟹猴神经干细胞的培养与分化 免费阅读 下载全文
  • 背景:关于神经干细胞以往研究多集中在啮齿类和人类,涉及非人灵长类的神经干细胞研究较少。 目的:建立自蟹猴神经干细胞的体外分离培养方法,并观察其分化潜能。 设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-07/2009—04在中山大学干细胞与组织工程研究中心完成。 材料:孕3-5个月的食蟹猴流产胚胎,由蓝岛生物技术有限公司(华南非人灵长类研究开发中心)提供。 方法:取食蟹猴胚胎的室管膜下区及海马区脑组织,放入神经干细胞悬浮培养液中,巴氏吸管吹打分散,得到单细胞悬液,调整细胞浓度为(2.0-5.0)×10^5接种于25cm^2培养瓶中,在37℃、体积分数为5%的CO2条件下进行原代悬浮培养。待形成神经球2周后,接种于预先包被多聚鸟氨酸/纤维连接蛋白的培养板上进行贴壁培养。每天向孔内添加上皮生长因子和碱性成纤维生长因子各20μg/L.待细胞增殖到90%左右传代扩增。 主要观察指标:利用免疫细胞荧光化学技术,列体外培养的食蟹猴神经干细胞表面标志性抗原nestin及其分化潜能进行鉴定。 结果:悬浮培养1周后,倒露显微镜下可见神经球形成,神经球在培养过程中逐渐增大。第4周将神经球进行贴壁培养后,24h可见神经球贴附于板壁,并有突触从球中伸出,随后大量细胞从神经球中迁出。逐渐铺满板擘。添加上皮生长因子和碱性成纤维生长因子培养的神经干细胞呈nestin^+,而未添加两种因子的神经干细胞呈GFAP^+,Tuj 1^+,O4^+。 结论:悬浮培养与贴蹙培养相结合的方法较适合食蟹猴神经干细胞的培养及传代,分离出的食蟹猴神经干细胞具有分化为星形胶质细胞、神经元细胞、少突胶质细胞的能力。
  • 不同供者来源及不同传代次数人脂肪间充质干细胞端粒酶的活性检测 免费阅读 下载全文
  • 背景:目前对于脂肪间充质干细胞端粒酶的表达尚无统定论。 目的:探讨不同供者来源和不同传代次数的成人脂肪间充质干细胞是否表达端粒酶活性。 设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2009—08在中国医学科学院血液学研究所泰达生命科学技术研究中心完成。 材料:成人脂肪组织来源于天津怡丽医学美容整形门诊接受抽脂术的5例健康供者,Hela细胞由中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心提供。 方法:分别从每例健康供者抽取20mL脂肪组织,胶原酶消化法体外分离培养人脂肪间充质干细胞,待细胞生长至80%融合时胰酶消化传代。以Hela细胞作为对照。加入含体积分数为10%胎牛姐清的1640培养基,待细胞生长至80%融合时胰酶消化传代。 主要观察指标:人脂肪间充质干细胞的形态、表型、分化潜能,RT-PCR法检测人脂肪间充质干细胞端粒酶基因的表达,TRAP—ELISA法检测人脂肪间充质干细胞的端粒酶活性。 结果:实验分离得到的人脂肪间充质干细胞呈贴壁生长,显微镜下呈梭形,当细胞密度较大时表现出漩涡状生长;CD19,CD34.CD11b,CD45,HLA-DR呈阴性表达,CD73,CD90,CD105呈阳性表达;成脂诱导后油红O染色可见明显红色油滴,成骨诱导后Von Kossa染色可见黑包颗粒,提示有钙沉积。P1,P4,P7代人脂肪间充质干细胞均不表达端粒酶反转录酶基因。5例不同供者来源的脂肪间充质干细胞亦均不表达端粒酶反转录酶基因。Hela细胞具有端粒酶活性,人脂肪间充质干细胞不表达端粒酶活性。 结论:不同供者来源和不同传代次数的人脂肪间充质干细胞均不表达端粒酶mRNA,也无端粒酶活性。
  • 绿色荧光蛋白标记免骨髓间充质干细胞的成骨及成脂潜能 免费阅读 下载全文
  • 背景:为便于进步追踪骨髓间充质干细胞,常需对其进行标记。 目的:采用绿色荧光蛋白标记兔骨髓间充质干细胞,观察标记后其诱导成骨及成脂能力。 设计、时间及地点:细胞观察实验,于2007-12/2008—10在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室进行。 材料:4月龄健康新西兰大耳白兔6只,购自华中科技大学同济医学院动物实验中心。 方法:无菌条件下取兔双侧股骨,应用密度梯度离心法及贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞。取传至第3代细胞,用脂质体介导法将绿色荧光蛋白质粒转入。经G418筛选得到稳定转染的细胞,分别进行成骨、成脂诱导。 主要观察指标:骨髓间充质干细胞的形态、表面标志表达、绿色荧光蛋白标记情况,骨髓间充质干细胞成骨、成脂分化潜能。 结果:经原代及传代培养的骨髓间充质干细胞多呈纺锤形或梭形,成纤维细胞样,流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞CD44呈阳性表达,CD34呈阴性。经G418筛选后,镜下可见大量发出绿包荧光的骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞成骨诱导21d后有较多的钙盐沉积,茜索红染包呈红色;成脂诱导3d后,细胞内有小脂滴出现。2周后油红O染色示有大量脂质沉积。 结论:绿色荧光蛋白标记的兔骨髓间充质干细胞经诱导培养后具有多向分化潜能。
  • 不同质量浓度时转化生长因子β1将如何诱导大鼠骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞的分化 免费阅读 下载全文
  • 背景:在内膜损伤后炎症反应的过程中,间充质干细胞可以从骨髓释放到病灶处。参与损伤修复。但目前尚缺乏在细胞水平对转化生长因子β1如何促进骨髓间充质干细胞转化为平滑肌样细胞的分子机制研究。 目的:揭示体外实验条件下,血管急性损伤时不同质量浓度转化生长因子β1如何诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化。 设计、时间及地点:随机对照动物实验,体外诱导细胞观察,于2008—01/2009—05在上海交通大学医学院附属第九人民医院SPF级实验动物中心和上海交通大学医学院附属第九人民医院组织工程实验室完成。 材料:雄性SD大鼠24只,随机分为正常对照组、模型组,12只,组。另取4周龄雄性SD大鼠6只,用于分离制备骨髓间充质干细胞。 方法:①模型组大鼠建立颈总动脉急性损伤模型。取正常对照组及模型组大鼠损伤后1,3,7d的血清,运用双抗体夹心ABC-ELISA法检测血清中转化生长因子β1的水平。②第1次传代后的大鼠骨髓间充质干细胞以(1.0~3.0)×10^5个/100mm培养皿的密度接种,设立2组:常规培养组仅加入含体积分数为20%的胎牛血清高糖DMEM基础培养液:转化生长因子β1诱导组在常规培养组基础上,分别给予1,3,5,10μg/L转化生长因子β1诱导1周。 主要观察指标:损伤后血清中转化生长因子β1的表达;相差倒置显微镜观察诱导后细胞形态学变化;平滑肌细胞标志物α-肌动蛋白的表达。 结果:①正常对照组大鼠血清中转化生长因子61的质量浓度较低;模型组大鼠损伤后1d血清中转化生长因子β1的质量浓度即已升高,损伤后3d达高峰,损伤后7d明显下降,但仍未完全恢复到基础水平。②骨髓间充质干细胞经转化生长因子β1诱导1周后,细胞融合成片,形成峰谷样外观。③免疫细胞化学检测结果显示,与常规培养组比较,1,3,5.10μg/L转化生长因子β1诱导组平滑肌细胞分化率均明显增加,尤其是5,10μg/L转化生长因子β1诱导组差异有显著性意义(P〈0.01)。实时定量PCR结果与免疫细胞化学检测结果相似。 结论:急性血管损伤后大鼠血清中转化生长因子β1呈高表达,并在损伤后3d达高峰。在体外,经类似此高峰浓度的转化生长因子β1诱导后,对骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化有较好的促进效应。
  • 上皮型钙粘蛋白在小鼠胚胎干细胞体外分化中动态表达及与细胞黏附状态关系 免费阅读 下载全文
  • d背景:体内胚胎期,上皮型钙粘蛋白对肝脏组织的发育起到决定作用,探讨其在胚胎干细胞分化中的动态表达对于肝脏组织的体外发育可行性具有重要意义。 目的:观察上皮型钙粘蛋白在小鼠胚胎干细胞体外分化过程中的动态表达,及其与细胞间黏附状态的关系。 设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007—12/2008—12在中山大学附属第一医院外科实验室完成。 材料:BALB/c系小鼠胚胎干细胞由中山大学眼科中心黄冰教授建系和保存。清洁级BALB/c系孕13d小鼠20只,由中山大学实验动物中心提供。 方法:BALB/c系小鼠胚胎干细胞克隆经胰酶消化后,利用含胎牛血清、2巯基乙醇、HEPES、青霉索、链霉素的DMEM培养基悬浮培养,使其自然发育5d形成拟胚体,第6天转至培养板使其贴壁生长。取BALB/c系孕13d小鼠,取其胎鼠肝脏组织制备胎肝细胞及冰冻切片,作为对照组。 主要观察指标:按胚胎干细胞初分化、拟胚体形成、细胞分化群落形成等阶段,于细胞分化第1,5,9,13,17天利用RT-PCR和免疫细胞化学法检测上皮型钙粘蛋白的表达,观察其表达水平与细胞黏附状态的关系。 结果:RT—PCR检测结果显示,在胚胎干细胞自然分化系统中,上皮型钙粘蛋白mRNA于分化第1天未表达,在第5天拟胚体形成后表达最强,其后表达能力逐渐降低,至17d时不再表达,作为对照的BALB/c系小鼠胎肝细胞表达较强的上皮型钙粘蛋白mRNA。免疫细胞化学检测结果亦体现相同规律。胚胎干细胞在形态学上由单细胞发育为致密的包含3胚层结构的拟胚体,再继续分化为松散的细胞群落。 结论:上皮型钙粘蛋白在胚胎干细胞体外培养系统中的表达水平与分化细胞间黏附状态变化呈一定的相关性,其在体外环境中丧失表达可能是分化细胞不能组织化的一个重要原因。
  • 钙黏蛋白11和核心结合因子α1双基因修饰人骨髓间充质干细胞 免费阅读 下载全文
  • 背景:钙黏蛋白11对骨髓间充质干细胞进行基因修饰,可促进细胞的黏附性能。利用核心结合因子α1对骨髓间充质干细胞进行基因修饰,育望实现多能干细胞的成骨定向分化,并在诱导成骨分化的级联效应中发挥重要的信号作用。 目的:拟采用腺病毒为载体,介导钙黏蛋白11、核心结合因子α1基因修饰骨髓间充质干细胞,观察两基因的表达情况。 设计、时间及地点:细胞-基因学实验,于2008—08在珠江医院中心实验室完成。 材料:入骨髓间充质干细胞来源于1例胸椎骨折男性患者,由珠江医院提供,患者对实验知情同意。钙黏蛋白11全长cDNA质粒由日本神户理研Riken分子生物中心Takeichi教授惠赠,全长核心结合因子α1基因质粒由美国Baylor医学院Ducy博士提供,pAdeasy腺病毒系统由美国约翰霍普金斯遗传所Bert博士馈赠。 方法:Percoll密度梯度离心+贴壁法分离培养人骨髓间充质干细胞。利用PCR技术获得钙黏蛋白11和核心结合因子α1基因,分别构建到腺病毒穿梭载体上,然后分别通过同源重组获得重组腺病毒质粒,再将两病毒质粒包装获得重组病毒液,最后通过病毒将两基因导入骨髓间充质干细胞。 主要观察指标:Western blot法检测钙黏蛋白11、核心结合因子α1基因在人骨髓间充质干细胞中的表达。 结果:获得携带钙黏蛋白11和核心结合因子α1基因的病毒液,将其感染人骨髓间充质干细胞后,以Western blot检测两种基因同时获得高表达。 结论:实验成功构建钙黏蛋自11和核心结合因子α1基因腺病毒载体,通过病毒转染人骨髓间充质干细胞.二者获得高效表达。
  • 羊水干细胞分泌细胞因子及其对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响 免费阅读 下载全文
  • 背景:关于细胞移植的功效,重点在于其分泌的促增殖或抗凋亡的细胞因子,羊水干细胞能否分泌相关细胞因子订必要深入分析。 目的:观察分离培养的羊水干细胞分泌细胞因子情况,及其对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的作用。 设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008—12/2009—06在南昌大学第一附属医院高血压病研究所完成。 材料:10例剖宫产孕妇足月羊水,50mL/例,用于分离培养羊水干细胞,同时留取其产后脐静脉用于分离培养内皮细胞,取前均获孕妇知情同意。 方法:①贴壁法分离培养羊水干细胞,达80%融合时胰酶消化传代,取传至第3代细胞,调整细胞密度为5×10^8L^-1,分为2组:缺氧羊水干细胞组通入体积分数为2%O2+体积分数为5%CO2+体积分数为93%N2,常规羊水干细胞组通入体积分数为5%CO2+体积分数为95%空气,两组细胞37℃培养24h,收集各自培养上清液及细胞以备分析。②取体外分离培养的第2代人脐静脉内皮细胞,以2×10^4细胞/孔的密度接种于12孔板,分为3组:对照组加入含体积分数为5%胎牛血清的EBM-2新鲜培养液2mL,常规羊水干细胞组加入含体积分数为5%胎牛血清的EBM-2新鲜培养液1mL+羊水干细胞培养液1mL,缺氧羊水干细胞组加入含体积分数为5%胎牛血清的EBM-2新鲜培养液1mL+缺氧诱导羊水干细胞培养液1mL,培养3d,加入10μg/L肿瘤坏死因子α诱导细胞凋亡。 主要观察指标:流式细胞仪测定羊水干细胞表面抗原表达,ELISA法测定羊水干细胞分泌血管内皮细胞生长因子、肝细胞,生长因子情况,RT-PCR法测定细胞因子mRNA的表达,检测内皮细胞增殖率及凋亡率。 结果:培养7d后羊水干细胞呈长梭形,以漩涡状、辐射状排列,第3代羊水干细胞呈CD29^+,CD105^+,CD34^-。常规培养的羊水干细胞可分泌血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子;缺氧诱导条件下血管内皮细胞生长因子水平明显增加(P〈0.01),其mRNA表达明显上调(P〈0.05),而肝细胞生长因子含量及mRNA的表达均无明显变化(P〉0.05)。与对照组比较,培养3d后常规羊水干细胞组、缺氧羊水干细胞组内皮细胞数均明显增加(P〈0.05),肿瘤坏死因子α诱导凋亡24h后内皮细胞凋亡率均明显降低(P〈0.05),且缺氧羊水于细胞组变化幅度大于常规羊水干细胞组(P〈0.05)。 结论:羊水干细胞可分泌血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子,羊水干细胞培养液能促进内皮细胞增殖,抑制内皮细胞凋亡。经缺氧处理后,羊水干细胞分泌血管内皮细胞牛长因子的能力增加,对内皮细胞的增殖和凋亡干预作用增强。
  • 两步法分离和培养人羊水来源胚胎间充质干细胞的生物学特征 免费阅读 下载全文
  • 背景:目前对干细胞的体外分离纯化技术大多是建立在对细胞表面标记识别的基础之上,包括单抗贴壁铺展法、流式细胞分选法、免疫磁珠分选法等,但操作复杂,价格昂贵。 目的:观察两步法分离和培养人羊水来源胚胎间充质干细胞的生物学特征。 设计、时间及地点:开放性实验,于2008—03/2009—03在新疆医科大学干细胞研究室完成。 材料:10例羊水标本来自怀孕16-22周行产前诊断或自愿引产的孕妇,在超声引导下行羊膜腔穿刺取得20-40mL羊水。 方法:采用改进的两步培养法分离和培养人羊水间充质干细胞,首先同一步法将羊水标本离心、接种、培养至出现梭形细胞为主、类成纤维细胞的间充质干细胞集落。然后将七清培养液转移至新的25cm^2培养瓶中继续培养,至出现梭形细胞为主、类成纤维细胞的间充质干细胞集落且达70%汇合后消化,改用α-MEM培养基,同样添加碱性成纤维细胞生长因子,接种培养,记为第1代。 主要观察指标:①原代及传代羊水间充质干细胞形态学变化。②羊水间充质干细胞细胞核型、细胞周期、生长曲线和集落形成能力测定。③流式细胞仪、免疫荧光和RT-PCR检测表面抗原和细胞因子。 结果:实验成功分离、培养和传代人羊水间充质干细胞。①孕中期羊水细胞原代培养甲均7d可见散在的梭形细胞为主、类成纤维细胞的间充质于细胞集落;传代细胞在12h内完全贴壁,经过一两天潜伏期后增殖迅速,培养六七天可达90%融合,细胞排列有一定的方向性,早漩涡状、辐射状排列,细胞为长梭形,相互之间界限不清。②两种方法得到的羊水间充质干细胞染色体核型为正常二倍体核型;生长曲线均呈S形,但两步法在第(6.1±0.5)天就达到高峰,显著快于一步法第(7.2±0.6)天(P=0.035)。流式细胞仪检测结粜显示两步法羊水P3细胞S期细胞占(14±2.3)%,显著多于一步法(9.0±1.4)%(P=0.031)。两种方法获得的羊水间充质干细胞低密度种植7d肝,均可形成散在的细胞集落,但两步法集落形成率为(15.0±2.3)%,显著多于一步法(10.0±1.8)%(P=0.021)。③流式细胞仪柃测结果显示,羊水间充质干细胞表达CD44、CD29、CD105,而CD34、CD45、HLA-DR阴性;免疫荧光检测表明羊水中含有Oct-4阳性细胞,但两步法羊水间充质干细胞中Oct-4阳性细胞比例为(1.2±0.3)%。显蒋高于一步法(0.9±0.2)%(P=0.041);RT-PCR分析表明两种方法获得的羊水间充质干细胞均表达Oct-4。 结论:人羊水中也存在间充质干细胞,两步培养法是一种高效、简便实用而且不干扰常规产前诊断程序的方法。
  • 高度同源性人脂肪间充质干细胞体外分离培养条件的优化 免费阅读 下载全文
  • 背景:目前关于人脂肪间充质干细胞有效分离培养及扩增的方法尚未统一。 目的:拟在体外建立人脂肪间充质干细胞的有效分离方法。 设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2008—06/12在吉林大学病理生物学教育部重点实验室完成。 材料:手术切除的人腹部脂肪由吉林大学附属医院提供,提供者对实验均知情同意。 方法:取腹部脂肪,去除结缔组织和血管,用0.1%Ⅰ型胶原酶37℃振荡消化60min,过滤肝离心,将位于最下层的片状沉淀用含体积分数为10%胎牛血清的LG-DMEM条件培养基重悬,调整细胞密度至1×10^9L^-1接种于6孔板中,于37℃、体积分数为5%的CO2孵箱内培养,待细胞接近80%-90%融合时消化传代。取P3代细胞,分别进行成骨及成脂肪诱导。 主要观察指标:应用激光扫描共聚焦显微镜观察人脂肪间充质干细胞形态学特点;采用流式细胞仪和免疫荧光法检测其免疫学表型、细胞周期、生长曲线;观察其多向分化潜能。 结果:分离培养的人脂肪间充质干细胞为成纤维细胞样,呈漩涡状排列。P3代人脂肪间充质干细胞呈CD73,CD105,CD166,CD44及CD29阳性,而CD31,CD34,CD45及HLA—DR阴性;具有典型的干细胞增殖特点,83.81%细胞处于G0/G1期,仅16.19%细胞处于S+G2/M期;细胞在接种后前2d处于生长潜伏期,第3-6天处于对数生长期,第6天达峰值,以后细胞生长速度减慢,进入生长平台期,平均五六天传代1次。成骨诱导2周后,细胞碱性磷酸酶染色呈阳性;成脂诱导3d后,细胞内有小脂滴出现,油红O染色呈阳性。 结论:分离脂肪组织的过程中去除大体可见的血管与结缔组织可减少细胞污染;胶原酶浓度为0.1%和振荡消化时间为60min时,可使基质细胞和脂肪基质纤维成分有效分离,以及使胶原酶与组织得到充分接触,从而获得高度同源性的人脂肪间充质干细胞。
  • 平滑肌细胞纯化载体构建及在小鼠胚胎干细胞中的表达 免费阅读 下载全文
  • 背景:胚胎干细胞是平滑肌细胞最要的来源之一,但是胚胎干细胞分化细胞的异质性导致难以获得较纯的平滑肌细胞。 目的:为进一步纯化胚胎干细胞来源的平滑肌细胞,拟化体外构建平滑肌特异性SM22α启动子驱动的嘌呤霉索抗性(puromycin acetyltransferase,pac)基因与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)基因双表达载体,即pSM22-PAC-IRES2-EGFP载体,并在胚胎干细胞中检测其有效性及特异性。 设计、时间及地点:基因水平细胞观察实验,于2007-05/2008-09在解放军沈阳军区总医院全军心血管病研究所完成。 材料:小鼠胚胎干细胞系R1购自美国ATCC公司,编号SCRC-1011^TM。pSM22α-EGFP载体由本实验室构建;pIRES2-EGFP载体、pSM2C载体、pSuper.basic载体购自Invitrogen公司。 方法:用聚合酶链反应方法从pSM22α—EGFP中扩增SM22α启动子,然后用该启动子替换pIRES2-EGFP载体中的CMV启动子,构建pSM22-IRES2-EGFP。再从pSM2C中用HindⅢ/ClaⅠ酶切获得pac基因,将pac基因片段亚克隆到pSuper.basic中,构建pSuper-PAC。最后BgⅢ/MCCⅠ双酶切pSuper.PAC获得pac基因片段,将其插入到pSM22α—IRES2-EGFP,构建成pSM22α—PAC-IRES2-EGFP。将pSM22α-PAC-IRES2-EGFP用脂质体法转染胚胎干细胞,G418筛选阳性克隆。诱导胚胎干细胞阳性克降分化,RT—PCR扩增pac基因鉴定阳性克隆。对分化细胞行平滑肌细胞标志物SMα—actin免疫荧光染色。 主要观察指标:①pSM22α—PAC—IRES2-EGFP测序结果。②pac基因扩增。③荧光显微镜下同时观察分化细胞EGFP的表达及SMα—actin染色情况。 结果:HindⅢ/ClaⅠ双酶切得到261bp,664bp,5000bp3个片段,与预期结果一致,测序结果证实pSM22α—PAC—IRES2-EGFP构建成功。Pac基因扩增证实有4株胚胎干细胞克隆转染成功。转染成功的胚胎干细胞被诱导分化后,部分细胞表达EGFP,且这些细胞SMα—actin染色呈阳性。 结论:实验成功构建了平滑肌细胞筛选载体pSM22α-PAC-IRES2-EGFP。成功转染这一载体的肌胎干细胞表达pac基因及EGFP基因,且EGFP表达具有平滑肌特异性。
  • 系统性红斑狼疮患者血清α干扰素和白细胞介素6共同作用对造血干细胞定向分化为树突状细胞的影响 免费阅读 下载全文
  • 背景:系统性红斑狼疮与树突状细胞的功能活化密切相关。在体内,树突状细胞来源于造血干细胞,其分化成熟的过程受多种闪素的影响。系统性红斑狼疮患者血清中存在细胞因子网络失调,以往研究多关注予单一因子的参与作用。 目的:课题创新性提出和观察系统性红斑狼疮患者血清α干扰素和白细胞介素6共同作用下对CD34^+造血干细胞定向分化为树突状细胞的影响。 设计、时间及地点:分组对比观察,完全随机细胞学体外实验。于2006—05/2008-10在南京医科大学微生物与免疫学实验室完成。 材料:外周血标本取自50例就诊于南京医科大学第一附属医院风湿免疫科的系统性红斑狼疮患者,以及30例南京医科大学的健康志愿献血者。15份脐血标本取自南京医科大学附属南京妇幼保健院健康足月顺产的新生儿,产妇及其家属均对实验知情同意。 方法:无菌采集系统性红斑狼疮患者和正常对照苟的外周静脉血,根据正常人血清中α干扰素、白细胞介素6的浓度,采用百分位数法求得血清α干扰索、白细胞介素6浓度的95%参考值范围,并以浓度超过此范围为异常升高。取新生儿脐血,Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离脐血单个核细胞,免疫磁珠法纯化CD34^+造血干细胞,并诱导其定向分化为树突状细胞。在培养过程中设立6组,分别加入:正常对照血清、α干扰素升高的系统性红斑狼疮血清、白细胞介素6升高的系统性红斑狼疮血清、α干扰素和向细胞介素6同时升高的系统性红斑狼疮血清、混合α干扰素及自细胞介素6中和抗体的系统性红斑狼疮血清、混合外源性α干扰素和白细胞介素6的正常对照者血清,各组血清休积分数均为10%,培养14d。 主要观察指标:流式细胞仪检测树突状细胞的表型,ELISA法检测树突状细胞分泌细胞因子的水平,混合淋巴细胞反应检测树突状细胞刺激同种异体T细胞增殖的能力,及其对T细胞亚群分化率影响。 结果:①与正常血清对照比较,α干扰素、白细胞介素6及二者同时升高的系统性红斑狼疮血清、混合外源性α干扰素和白细胞介素6的正常对照者血清诱导培养的树突状细胞其HLA-DR,CD80,CD86的表达均明显升高(P〈0.05),分泌白细胞介素12的水平均明显降低(P〈0.05),刺激T细胞增殖能力均明显增强(P〈0.05)。混合α干扰素及白细胞介素6中和抗体的系统性红斑狼疮血清诱导培养的树突状细胞上述各项指标均恢复至正常血清对照水平。②与正常血清对照比较,白细胞介素6升高的系统性红斑狼疮血消其CD3^+CD8^-IFN-γ^+、CD3^+CD8^+IFN-γ^+细胞亚群百分率明显下降(P〈0.05);α干扰素升高的系统性红斑狼疮血清、α干扰素和白细胞介素6同时升高的系统性红斑狼疮血清、混合外源性α干扰素和白细胞介素6的正常对照者血消其CD3^+CD8^-IFN-γ+和CD3^+CD8^+IFN-γ^+细胞亚群百分率均明显升高(P〈0.05)。 结论:系统性红斑狼疮血清α干扰素和白细胞介素6的共同作用对CD34^+造血干细胞定向分化为树突状细胞产生了异常影响,可促进树突状细胞的表型成熟和功能活化,并间接影响T细胞亚群的分化,可能参与系统性红斑狼疮的发病。
  • 大鼠胚胎后肾间充质细胞体外标记的方法 免费阅读 下载全文
  • 背景:干细胞移植为慢性肾脏病的治疗提供了新的视角,特异性标记干细胞并体内示踪是这一领域研究的基础,目前尚无一种公认的适用于所有细胞的标记方法。 目的:观察DAPI及绿色荧光蛋白标记细胞在阿霉素肾病大鼠体内的定位及分化,探讨便捷的大鼠胚胎后肾间充质细胞的体外标记方法。 设计、时间及地点:分组对比观察,于2007—04/12在中南大学湘雅二医院完成。 材料:清洁级雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只。体质量180-220g,用于制备阿霉素肾病大鼠模型。 方法:分别将DAPI、DAPI体外标记后肾间充质细胞、绿色荧光蛋白体外标记后肾间充质细胞,通过尾静脉注入阿霉素肾病大鼠体内;于细胞移植后1,3,5周行肾组织冰冻切片,观察DAPI及绿色荧光蛋白荧光分布,并ABC免疫酶染色法检测肾组织中绿色荧光蛋白表达。 主要观察指标:比较DAPI及绿色荧光蛋白两种不同方法标记后肾间充质细胞在阿霉素慢性肾病大鼠肾内的定植情况,以及绿色荧光蛋白标记细胞不同时间点移植在肾内的定植改变。 结果:①DAPI标记细胞及单纯DAPI尾静脉注射后1周,均可在。肾小管上皮细胞中观察到DAPI阳性细胞,至移植后5周仍可观察到,但随时间延长荧光有减弱趋势。②绿色荧光蛋白标记细胞移植后1周,可在肾小管上皮细胞中观察到绿色荧光蛋白阳性细胞。至移植后5周仍可观察到,荧光无明显减弱。③ABC免疫酶染色法检测,显示绿色荧光蛋白阳性细胞主要表达于近端肾小管中,肾小球系膜区亦可观察到少最表达;绿色荧光蛋白阳性产物主要表达于胞浆。绿色荧光蛋白表达半定量评分显示,标记细胞的早期应用阳性率大于晚期应用者,且随观察时间延长,阳性率有升高趋势。 结论:后肾间充质细胞的脂质体感染法绿色荧光蛋白标记是一便捷、有效的体外标记、示踪方法,适于移植细胞的短期内示踪、观察。
  • 体外诱导分化多巴胺能神经元的分子特征 免费阅读 下载全文
  • 背景:一系列研究表明,腹侧中脑多巴胺能前体细胞可在体外经人工诱导分化为大量多巴胺能神经元,有望用于移植治疗帕金森病,但是其分子特征尚不明了。 目的:观察体外培养得到的多巴胺能神经元标记基因的表达情况。 设计、时间及地点:观察性实验,于2005—12/2008—12在苏州大学附属第二医院神经外科脑肿瘤研究室以及上海生物芯片有限公司完成。 材料:健康成年近交系Wistar孕鼠(〉36代),体质量约300g,用于中脑细胞体外培养。 方法:取材培养胎鼠腹侧中脑细胞,先用碱性成纤维细胞生长因子进行扩增,而后用L-抗坏血酸-2-磷酸酯倍半镁盐诱导其分化。分别于诱导前和诱导后第4天,第7天抽提RNA后利用Affymetnx基因芯片检测多巴胺能神经元标记基因的表达变化。 主要观察指标:①多巴胺能前体细胞诱导分化后形态变化。②常见多巴胺能神经元标记基因在诱导分化前后过程中的表达。 结果:大鼠腹侧中脑多巴胺能前体细胞可在体外被大量诱导分化成酪氨酸羟化酶阳性细胞,并且不同程度地表达多种多巴胺能神经元标记基因乙醛脱氢酶1A1亚家族、钙结合蛋白1、多巴脱羧酶、多巴胺转运体、G蛋白门控内向整流钾通道、囊泡单胺转运体2。随着细胞诱导分化的进行,这些标记基因表达的变化趋势也不尽相同,其中显著上调的标记基因为钙结合蛋白1,而显著下调的标记基因为G蛋白门控内向整流钾通道。 结论:大鼠腹侧中脑多巴胺能前体细胞可在体外大量诱导分化成酪氨酸羟化酶阳性的主要源自中脑腹侧被盖区(A10)的多巴胺能神经元。
  • 人胚胎干细胞无血清无饲养层培养体系的建立 免费阅读 下载全文
  • 背景:研究表明FGF2,TGFB,activin/nodal和IGF信号通路是人胚胎干细胞保持其多能性所必需的,然而直接添加外源性碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β和胰岛素是否能够维持人胚胎干细胞的自我更新目前尚无报道。 目的:拟建立人胚胎干细胞无饲养层无血清条件下的培养体系。 设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007—09/2009-02在中国科学院昆明动物研究所完成。 材料:12.5-13.5d龄清洁级ICR孕鼠2只,由昆明医学院动物中心提供。人胚胎干细胞株BG02购自美国Bresagen公司。 方法:①消化离心BG02细胞,重悬于无饲养层过渡培养基后接种,常规培养5-7d,挑去分化的人胚胎干细胞,加入分散酶消化,切割成小团块,离心重悬后按1:3比例重新接种预铺层粘连蛋白的4孔板,此时培养基换成无血清无饲养层培养基,由80%DMEM/F12、20%KSR、2mmol/L glutamine、1%非必需氨基酸、0.1mmol/L β-巯基乙醇、ITS(×1)、10^6 U/L青霉素、100mg/L链霉素、4μg/L碱性成纤维细胞生长因子、0.12μg/L转化生长因子β1组成。②无菌条件下取出ICR胎鼠,组织块胰酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,接种在0.1%明胶包被的6孔板中即为饲养层。将生长在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细胞株BG02预铺至有层粘连蛋白的培养板上,加入含碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1及ITS的无血清培养基连续培养。 主要观察指标:观察BG02细胞在无血清无饲养层培养体系中的形态,采用细胞免疫组化法检测人胚胎干细胞特异性分子标志的表达,检测BG02细胞体外分化能力及其核型,比较BG02细胞在无血清无饲养层和小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系中的生长情况、细胞集落分化率。 结果:在无血清无饲养层培养体系中,BG02细胞连续传代20代,细胞呈典型的人胚胎干细胞形态特征;BG02细胞表达SSEA-4,SSEA-3,TRA-1-60,TRA-1-81,Oct-4,但不表达SSEA-1:培养20d后,BG02细胞进一步分化成3个胚层的细胞,分化细胞能够表达甲胎蛋白、巢蛋白、α-肌动蛋白;培养至20代细胞核型均正常(46XY)。与在饲养层培养体系下比较,无血清无饲养层条件下BG02细胞BG02细胞生长速度减慢,细胞倍增时间明显延长(P〈0.05),集落分化率明显升高(P〈0.05)。 结论:实验初步建立了人胚胎干细胞无血清无饲养层的培养体系,添加碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1和ITS可以维持人胚胎干细胞的自我更新。
  • 构建免髓核细胞诱导人骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的体外模型 免费阅读 下载全文
  • 背景:目前尚缺乏诱导骨髓间充质干细胞向髓核细胞转化的体外模型。 目的:建立兔髓核细胞诱导人骨髓间充质干细胞分化为类髓核细胞的体外模型,为髓核细胞体内移植培养种子细胞提供实验依据。 设计、时间及地点:对比观察,于2008—08/2009—03在表岛大学医学院附属医院骨科研究所和中心实验室完成。 材料:8周龄新西兰大白兔2只用于兔髓核细胞的分离培养:人椎间盘髓核组织为术中取白16岁先天性脊柱侧弯患者T12L1、L1、2椎间盘髓核组织,患者家属知情同意。人骨髓间充质干细胞株为广州赛业生物科技有限公司产品。 方法:将人骨髓间充质干细胞和兔髓核细胞新式分层共培养(应用去掉挂臂、膜孔为0.4μm的小室,膜底与贴壁细胞相接触。膜上下两种细胞比例为50%:50%)7d,同时设立传统的分层培养(带有持臂的小室)组、单独人骨髓间充质干细胞培养组和髓核细胞培养组为对照。 主要观察指标:反转录-聚合酶链反应和Western blot榆测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达。 结果:传统分层培养组及单独人骨髓间充质干细胞培养组不表达蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。新式分层培养组、单独髓核细胞培养组Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA表达均高于传统分层培养组、单独人骨髓间充质干细胞培养组(P〈0.01)。新式分层培养组与单独髓核细胞培养组比较及传统分层培养组与单独人骨髓间充质干细胞培养组比较,差异无显著性意义(P〈0.05)。 结论:新式分层培养人骨髓间充质干细胞能较高的表达蛋白聚糖和Ⅱ型胶原,接近椎间盘末退变人的髓核细胞表达水平,表明成功建立兔髓核细胞诱导人骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的体外模型,为椎间鼎退变的细胞治疗奠定了基础。
  • 昆明鼠胚胎干细胞系的建立及其特性 免费阅读 下载全文
  • 背景:到目前为止,国际上通用的动物胚胎干细胞细胞系大多是从129品系和C57BU6系小鼠中获得的,少部分来自BALB/C系,来自于中国昆明鼠则鲜有报道。 目的:分离培养昆明系小鼠胚胎干细胞,并对其生物学特性进行初步鉴定。 设计、时间及地点:以细胞为对象的观察性实验,于2006—05/2007—06在南昌大学第一附属医院泌尿外科研究所完成。 材料:昆明小鼠3.5d胚龄的囊胚。 方法:自昆明系小鼠3.5d胚龄的囊胚分离内细胞刚细胞,接种于小鼠原代胚胎成纤维细胞饲养层上,对分离的内细胞团细胞进行扩增、传代培养。 主要观察指标:观察胚胎干细胞集落的生长情况,对其碱性磷酸酶表达进行染色分析,采用免疫荧光法检测其阶段特异性胚胎抗原1表达,以反转录-聚合酶链反应检测其特异性表达因子c-Myc,Nanog,Oct3/4和Sox2的基因表达情况,并对其体内外分化能力对进行鉴定分析。 结果:分离、培养自内细胞团的细胞呈典型的胚胎干细胞集落样生长,碱性磷酸酶染色及阶段特异性胚胎抗原1荧光染色阳性,细胞表达c-Myc,Nanog,Oct3/4和Sox2等基因,细胞在体内外均能分化成来源于不同胚层的多种细胞类型。 结论:成功从昆明小鼠囊胚中分离并建立一株胚胎干细胞系,其生物学特性与其他胚胎干细胞株相符。
  • 学科新闻:Lhx2控制着干细胞向嗅觉皮质方向的分化 免费阅读 下载全文
  • 大脑皮质是人类大脑最大最复杂的组成部分,哺乳动物尤其是人类,具有高度发达的大脑皮质,虽然已知组成大脑皮质的神经元最初都是由干细胞分化而来,并且不可逆地形成大脑皮质各个不同区域,但千细胞分化成各类神经元的机制一直是科学界还未解开的谜。
  • 让昨天告诉今天:2005年国际神经干细胞研究的学术与技术进展 免费阅读 下载全文
  • 干细胞研究的热中之热:毛囊干细胞可以治愈神经损伤吗? 美国和日本科学家成功地使毛囊干细胞分化成神经胶质细胞,并使因坐骨神经损伤而瘫痪的实验鼠正常行走。科学家们说,这一研究成果显示了毛囊干细胞有更广泛的医疗应用潜力。
  • 本期专题文章介绍:干细胞移植与心肌梗死 免费阅读 下载全文
  • 1 骨髓间充质干细胞移植联合冠心Ⅱ号对大鼠急性心肌梗死心功能和血管新生的影响 推荐理由:文章选取具有深厚研究基础的中药冠心Ⅱ号作为工具药,从改善骨髓间充质干细胞赖以生存是心肌微环境角度,探讨中药对干细胞移植治疗心肌梗死的促进作用,为中药的应用探索一条新途径。同时实验过程中采用骨髓间充质干细胞的鉴定及标记、心功能检测和免疫组化、免疫荧光、荧光定量RT-PCR等技术,检测指标全面,见2008年47期920页。
  • 干细胞医学词汇中英文对照 免费阅读 下载全文
  • 医学英文句型正误辨析 免费阅读 下载全文
  • CRTER杂志“干细胞研究”栏目本月组稿重点 免费阅读 下载全文
  • 2009年干细胞研究关注重点 高通量干细胞分离、培养、筛选、纯化和鉴定的技术。 安全、高效、简便、经济产生多能干细胞的技术和方法。
  • 同种异体骨髓间充质干细胞移植急性心肌梗死大鼠缝隙连接蛋白43及缝隙连接蛋N45 mRNA的表达 免费阅读 下载全文
  • 背景:细胞移值可以修复受损的心肌组织。但移植细胞是否和宿主细胞形成有效的电-机械偶联,并引起移植后细胞缝隙连接蛋白重构及心律失常等尚缺乏系统观察。目前只有少数研究发现心肌梗死后缝隙连接蛋白45表达上调,而对于骨髓间充质干细胞移植后缺血区缝隙连接蛋白45的表达尚无报道。 目的:课题组假设通过改变缝隙连接蛋白水平、干预异常的GJ通道,来尝试治疗心肌梗死后心律失常,为此探讨同种异体骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死大鼠缝隙连接蛋白43及缝隙连接蛋白45mRNA表达的影响。 设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-01/2009-05在广西医科大学实验中心完成。 材料:健康Wistar大鼠180只,随机分为正常对照组、假手术组、心肌梗死组、细胞移植组,45只/组。各组按干预后4,8,12周又分为3个亚组,15只/亚组。另取1月龄健康雄性Wistar大鼠20只,用于分离培养骨髓间充质干细胞。 方法:取传至第3代的大鼠骨髓间充质干细胞,加入10μmol/L 5-氮胞苷进行诱导,4周后用于移植,在移植前2h行DAPI标记。心肌梗死组、细胞移植组大鼠建立急性心肌梗死模型,假手术组只穿线不结扎冠状动脉。造模后7d,细胞移植组将2×10^10 L^-1骨髓间充质干细胞悬液分多点注射到心肌梗死的边缘区和中心区,心肌梗死组、正常对照组、假手术组均注射等最生理盐水。 主要观察指标:荧光定量PCR法检测缝隙连接蛋白43及缝隙连接蛋白45mRNA的表达。 结果:①干预后4,8,12周,备组正常区缝隙连接蛋白43、缝隙连接蛋白45mRNA表达基本相似。②与正常区比较,心肌梗死组、细胞移植组缺血区的缝隙连接蛋白43mRNA表达均显著减少(P〈0.01)。缝隙连接蛋白45mRNA表达均显著增加(P〈0.01)。③同一时间点与心肌梗死组比较,细胞移植组缺血区缝隙连接蛋白43mRNA表达湿著增高(P〈0.01),缝隙连接蛋白45mRNA表达显著减少(P〈0.01)。 结论:课题创新性证实急性心肌梗死导致心肌缝隙连接蛋白43mRNA水平下降,缝隙连接蛋白45mRNA水平升高。5-氮胞苷诱导的同种异体骨髓间充质干细胞移植后,能上调梗死边缘区缝隙连接蛋白43mRNA的表达,并下调边缘区缝隙连接蛋白45mRNA的表达。
  • 法舒地尔与骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤:有协同效应吗? 免费阅读 下载全文
  • 背景:研究证实,Rho激酶抑制剂法舒地尔可以有效阻断继发性脊髓损伤过程。 目的;观察法舒地尔对骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤大鼠运动功能恢复的影响。 设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008—11/2009-03在天津医科大学内分泌研究所完成。 材料:1月龄SD大鼠1只,用于分离制备骨髓间充质于细胞。健康雌性SD大鼠30只,用于建立脊髓损伤动物模型,随机分成单纯损伤组、细胞移植组、细胞移植+法舒地尔组,10只/组。法舒地尔为天津红目药业公司产品。 方法:造模1周后,细胞移植组、细胞移植+法舒地尔组大鼠显露脊髓损伤区域,注入10μL骨髓间充质干细胞悬液。此外,细胞移植+法舒地尔组6h后开始腹腔注射10mg/kg法舒地尔,2次/d,连续用药1周。 主要观察指标:斜板实验检测后肢运动功能,病理切片苏木精伊红染色结果,HRP逆行神经示踪,Western—Blot法检测脊髓组织Phospho-ERM蛋白的表达。 结果:①造模后8周,与单纯损伤组比较,细胞移植组及细胞移植+法舒地尔组大鼠刳板试验角度均显著增加(P〈0.05,P〈0.01),且后者增加幅度明显大于前者(P〈0.05)。②单纯损伤组损伤处脊髓组织断裂,有明显空洞形成;细胞移植组、细胞移植+法舒地尔组可见少量神经轴索样结构,但细胞移植组的组织空洞大于细胞移植+法舒地尔组。③单纯损伤组至T8以上节段可见较少的HRP阳性颗粒标记的神经纤维;细胞移植组HRP阳性神经纤维数居中;细胞移植+法舒地尔组可见较多HRP阳性颗粒标记的神经纤维。④单纯损伤组、细胞移植组脊髓细胞Phospho—ERM蛋白的表达均明显高于细胞移植+法舒地尔组(P〈0.05)。 结论:骨髓间质干细胞移植对于脊髓损伤大鼠后肢运动功能的恢复有促进作用,联合应用法舒地尔可产生协同效果。
  • 骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠肾脏辐射损伤 免费阅读 下载全文
  • 背景:研究发现骨髓间充质干细胞可向包括肾脏系膜细胞在内的肾实质细胞分化,且肾损伤后骨髓间充质干细胞具有修复肾脏结构和功能的作用。 目的:观察肾脏辐射损伤大鼠模型接受骨髓间充质于细胞移植后肾脏组织学及功能学变化。 设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2009—01/10在珠江医院血液科实验室完成。材料:清洁级雄性SD大鼠35只,20只用于制备骨髓间充质干细胞,剩余15只随机分为正常对照组、模型组、细胞移植组,5只/组。 方法:全骨髓法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,细胞达90%融合时胰酶消化传代。模型组、细胞移植组大鼠建立辐射损伤模型,接受X射线全身照射,剂量率为500cGY/min,距靶源100cm,每次剂量6Gy,1次/周,连续3周。接受照射完毕后24h,取处于对数生长期的第3代骨髓间充质干细胞,细胞移植组大鼠经尾静脉注射1mL细胞悬液,含3×10^6个细胞,共3次;正常对照组、模型组大鼠尾静脉注射同等体积的生理盐水。 主要观察指标:肾脏组织学苏木精-伊红染色结果,血清和肾脏组织中超氧化物歧化酶及丙二醛的表达,血清中肌酐和尿素氮的表达。 结果:①肾脏组织病理显示,模型组肾皮质变薄,间质增多:肾小体分布不均匀;肾小球结构紊乱,肾小球血管及出、入球血管变窄,肾小囊腔部分消失;可见部分肾小球变性硬化表现。细胞移植组肾皮质较模型组明显增厚,结构较清晰,间质充血水肿明显减轻;可见较多完整的肾小体:部分肾小球仍存在变性、硬化表现,可见明显的肾小囊腔。②氧自由基检测结果显示,与模型组比较,细胞移植组大鼠血清和肾脏组织中超氧化物歧化酶的活性均明显升高(P〈0.05),丙二醛水平均明显降低(P〈0.05)。③肾功能检测结果显示与模型组比较,细胞移植组大鼠血清中肌酐和尿素氮浓度明显降低(P〈0.05)。 结论:骨髓间充质干细胞移植具有对抗和修复辐射损伤大鼠肾脏的作用,能够有效改善肾脏功能。
  • 自体骨髓干细胞动员移植与手术移植治疗脊髓损伤的比较 免费阅读 下载全文
  • 背景:研究表明,骨髓干细胞可在损伤脊髓中存活、向损伤部位迁移并向神经元和星形胶质细胞分化,促进损伤脊髓功能的恢复,是治疗脊髓损伤的一条有效途径。自体骨髓干细胞动员移植与手术移植治疗脊髓损伤均具有更广阔的临床应用前景,但两者的疗效与治疗机制是否存在区别还不清楚。 目的:比较白体骨髓干细胞动员移植与手术移植治疗脊髓损伤的效果,并以定性定量化指标评价。 设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-06/2008—04在河南省人民医院完成。 材料:10周龄SD大鼠90只,雌雄各半,体质量(240±10)g,用于制备脊髓损伤模型。 方法:动物造模前注射5-溴2-脱氧尿嘧啶核苷50mg/(kg·d)×3d后抽取自体骨髓,体外分离自体骨髓干细胞;NYU Impactor制作脊髓损伤模型。90只模型大鼠按随机数字表法分为3组,每组30只。动员移植组:应用重组粒细胞刺激因子皮下注射,20mg/(kg·d)×7d:手术移植组为损伤局部移植0.3mL(1×10^10L^-1)骨髓间充质干细胞;对照组:脊髓损伤后给予相同体积(0.3mL)的生理盐水。各组均从术前3d开始,连续10d腹腔注射5-溴2-脱氧尿嘧啶核苷50mg/(kg·d)。 主要观察指标:采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分检测伤后3d,1,2,4,8周大鼠后肢的运动功能;伤后1,2,4,8周通过体感诱发电位和运动诱发电位检测脊髓上、下行神经传导通路,判断脊髓损伤和恢复程度;病理和免疫组织化学观察脊髓损伤组织细胞结构变化及5-溴2-脱氧尿嘧啶核苷、胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶分布表达。 结果:①脊髓损伤后1,2,4,8周动员移植组和手术移植组BBB评分均较对照组升高(P〈0.01):动员移植组和手术移植组相比.差异均无履著性意义(P〉0.05)。②脊髓损伤1,2,4,8周后,与对照组相比,动员移植组和手术移植组体感诱发电位和运动诱发电位潜伏期均降低(P〈0.05-0.01),波幅均增高(P〈0.05-0.01);动员移植组和手术移植组各时间点相比,差异均无显著性意义(P〉0.05)。③组织病理学显示动员移植组和手术移植组较对照组有更少的空洞、坏死及胶质纤维酸性蛋白瘢痕组织.较多的5-溴2-脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞和特异性烯醇化酶阳性细胞。 结论:自体骨髓干细胞动员移植和手术移植两种方法均能明显减轻脊髓损伤的程度,促进损伤后脊髓功能的恢复,两者对比,前者更为方便、无创,实用性强。
  • 脐带血清和成人自体血清体外培养人骨髓间充质干细胞的比较 免费阅读 下载全文
  • 背景:为避免骨髓间充质干细胞培养过程中应用异种血清的排斥以及提高骨髓间充质干细胞培养效率,制备脐带血清体外扩增培养骨髓间充质干细胞是目前的研究热点。 目的:比较脐带血清和成人自体血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性。 设计、时间及地点:开放性实验,于2006—10/2008-06在中南大学湘雅二医院细胞生物实验室完成。 材料:16份骨髓标本由中南大学湘雅二医院和湖南省湘潭市中心医院提供。 方法:采用Ficoll Paque细胞分离液从16例新鲜成人骨髓穿刺液中分离骨髓间充质干细胞,分别用含体积分数为10%脐带血清、成人自体血清的DMEM/F12培养基培养,取第4代细胞进行实验。流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系及脂肪诱导体系分别诱导各组骨髓间充质干细胞定向分化,通过细胞形态观察、免疫表型及免疫化学染色进行鉴定。 主要观察指标:①细胞形态。②骨髓间充质干细胞计数和细胞周期。③表面标志物的鉴定。④免疫组织化学染色观察骨髓间充质干细胞诱导成骨、成脂情况。 结果:①脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞在增殖数量和速度上优于成人自体血清组(P〈0.05)。两种血清培养条件下,只有少数细胞处于活跃的增殖期,脐带血清组S期细胞多于成人自体血清组(P〈0.05)。②脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞表达CD29、CD73、CD105的阳性率均在90%以上,高于成人自体血清组(P〈0.05):而CD31、CD34、CD45的阳性率均在2%以下,CD31阳性率低于成人自体血清组(P〈0.05)。③脐带血清培养的骨髓间充质干细胞诱导为成骨细胞阳性率和脂肪细胞阳性率均高于自体血清组(P〈0.05)。 结论:脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞的纯度和体外诱导分化能力比成人自体血清组高,更适合临床应用。
  • Y染色体原位杂交在追踪间充质干细胞上的应用 免费阅读 下载全文
  • 背景:间充质干细胞移植治疗多发性硬化症是一种被目渐关注的新型治疗手段。然而,间充质干细胞是通过穿越血脑屏障发挥细胞替代作用还是通过免疫抑制发挥治疗作用仍有待进一步验证。 目的:建立稳定有效的Y染色体原位杂交方法,观察间充质干细胞在多发性硬化症模型小鼠中的分布。 设计、时间及地点:观察性实验,于2007—09/2009—02在健康科学研究所分子免疫学实验室完成。 材料:C57BL/6小鼠30只,6-8周龄,体质量15-20g,雌鼠用于建立实验性自身免疫性脑脊髓炎模型。 方法:用地高辛标记了针对Y染色体的DNA探针,进行原位杂交验证探针的特异性和敏感性。再将从雄鼠中分离的间充质干细胞移植到雌性实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠体内,进行原位杂交。 主要观察指标:光学和荧光显微镜观察间充质干细胞在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠体内的分布情况。 结果:实验确立了探针的Y染色体特异性和敏感性,进一步建立了有效的原位杂交方法。追踪到间充质干细胞在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的脊髓内分布极少,而外周免疫器官内有一定数量的分布,表明间充质干细胞可能是通过外周免疫调节发挥治疗作用。 结论:在外周脾和淋巴结内有一定数量的间充质干细胞分布,而在中枢神经系统的脊髓内只有极少数的间充质干细胞。
  • 改良小鼠骨髓间充质干细胞培养方法及长效荧光标记的可行性 免费阅读 下载全文
  • 背景:小鼠骨髓间充质干细胞培养不同于人及大鼠,培养扩展难度高,传代后干细胞活性保持时间短;又鉴于干细胞本身特点。使现有干细胞示踪方法作用时间短,这些因素均影响小鼠骨髓间充质干细胞的实验研究。 目的:观察改良小鼠骨髓间充质于细胞分离培养方法及长效荧光标记干细胞的可行性。 设计、时间及地点:观察性实验,于2008—06/12在解放军军事医学科学院完成。 材料:C57BL/6小鼠4-6周龄,体质量20g,雌雄不拘。 方法:通过贴壁筛选和Percoll分离法,优化干细胞培养液血清和换液方式,培养扩增小鼠骨髓间充质干细胞。参照以往人和猕猴间充质干细胞培养经验,对小鼠间充质干细胞培养血清选择Hyclone的顶级胎牛血清,控制血清为培养液的10%。用LG-DMEM培养液冲出骨筒细胞后,滤去骨渣和小肌肉碎块。然后加在相对密度1.082的percoll分离液上,以1.5×10^6/cm^2浓度接种75cm^2培养瓶。对第2代骨髓间充质干细胞进行长效CM—Dil标记。 主要观察指标:原代及传代小鼠骨髓间充质干细胞形态变化;对第2代小鼠骨髓间充质干细胞表面抗原,CD105,CD44,CD25,CD34进行流式细胞仪检测,评价改良方法获取干细胞纯度;通过成脂成骨分化,鉴定小鼠骨髓间充质干细胞的活性;观察多次传代后荧光细胞强度。 结果:①小鼠骨髓间充质干细胞原代培养在接种48h后可见贴壁细胞,培养第7天细胞多数伸展呈梭形,也有三角形、多角形和扁平形。3代后形态趋于统一,融合状态时细胞排列呈束状、漩涡状或放射状。②骨髓间充质干细胞特异性抗原高表达CD105,CD44;造血系抗原低表达CD34和CD45。③骨髓间充质干细胞向成骨分化过程中,纺锤形的突起逐渐消失,胞体增大,培养10d后,部分细胞呈聚集生长,随细胞生长密度的增长形成多层的结节结构。在脂肪诱导体系中,可见细胞由成纤维样逐渐缩短,9d后胞浆中出现脂肪滴,油红O染色可见红色的脂肪颗粒。④首次标记,荧光显微镜观察可见长效CM-Dil标记在细胞膜发橙色光,标记率在80%以上。流式细胞仪检测CM-Dil细胞标记率可到47%以上,第4代培养细胞仍可见较多标记细胞。 结论:改良方法早期第2代就可获得高浓度干细胞,同时长效CM—Dil标记方法稳定,标记率高,可作体内细胞示踪。
  • 糖皮质激素对骨髓间充质细胞分化的影响 免费阅读 下载全文
  • 背景:糖皮质激素引起的髓内脂肪蓄积是由机体脂肪代谢异常在髓内形成的脂肪沉淀,还是由于激素直接作用于骨髓间充质细胞使细胞发生了分化,以及具体生成的过程目前还没有定论。 目的:观察不同浓度地塞米松对骨髓间充质细胞成脂分化的影响。 设计、时间及地点:观察性实验,于2007—01/2009-01在中国医科大学生物化学教研室完成。 材料:3或4周龄SD大鼠80只,体质量(110±10)g,雌雄不拘。 方法:分离培养大鼠骨髓间充质细胞,并进行传代,取第3代细胞作为实验标本。 主要观察指标:①倒置显微镜下观察骨髓间充质细胞在地塞米松10^-7mol/L浓度和正常培养状态下3,7,14,21d时的形态变化。②细胞碱性磷酸酶、SundanⅢ染色后骨髓间充质细胞的形态变化。③酚试剂法测定碱性磷酸酶活性。④四甲基偶氮唑盐法检测地塞米松对细胞增殖的影响。 结果:①原代细胞接种24h后,培养瓶底即出现少许贴壁细胞,多呈纺锤形或梭形;随着培养时间延长,贴壁细胞明显增多,呈放射状排列。传代后细胞分布均匀,呈典型的成纤维细胞样。地塞米松刺激后,细胞由援形变为多角形或不规则形,后期,随着浓度增大和作用时间延长,细胞团聚现象消失,很多贴壁的细胞悬浮、死亡。②在正常培养细胞中,没有或很少见到橘红色的脂肪颗粒着色,在含有地塞米松培养的细胞中,随着激素浓度增高和时间持续,细胞内SundanⅢ着色的脂肪颗粒明显增加。③在21d时,正常培养的细胞碱性磷酸酶活性值分别是10^-7,10^-7,10^-6mol/L地塞米松组的1.57倍,4.49倍和5.O倍。在7,14,21d时,正常培养的细胞碱性磷酸酶分别是相应10^-7mol/L地塞米松组的2.93倍,3.80倍和4.39倍,差异具有显著性意义(P〈0.05)。④高浓度地寒米松对细胞增殖活力的抑制效果明显。10^-7mol/L和10^-6mol/L与其他各组相比,差异具有显著性意义(P〈0.05)。 结论:大剂量地塞米松促进骨髓间充质细胞的脂肪生成,抑制成骨分化,并且随着浓度增高和作用时间延长,作用加强。
  • 兔骨髓间充质干细胞在肿瘤微环境诱导下向肌纤维母细胞的分化 免费阅读 下载全文
  • 背景:骨髓间充质干细胞可以促进肿瘤间质重构,但具体机制尚不明确,而肌纤维母细胞则是肿瘤间质重构过程中发挥重要作用的一类细胞。 目的:观察骨髓间充质干细胞在肿瘤微环境诱导下能否分化为肌纤维母细胞。 设计、时间及地点:细胞学体外观察及体内移植实验,于2006—06/2007—12在山东大学齐鲁医院低温医学实验室完成。 材料:3月龄雄性新西兰大白兔12只,购自山东省农业科学院。 方法:穿刺抽取兔骨髓,密度梯度法分离培养骨髓间充质干细胞,传至第2代行DAPI标记,调整细胞密度为5×10^10L^-1,分为2组:实验组加入含体积分数为10%胎牛血清、30% VX2瘤细胞株培养上清的低糖DMEM.对照组加入含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM,培养14d。向兔大腿肌肉内注入VX2细胞悬液,2周后触摸到生成肿瘤后,抽取DAPI标记的第2代骨髓间充质干细胞悬液100μL,从前后左右4个方向均匀回输入肿瘤组织内,3周后取材。 主要观察指标:采用免疫荧光法和RT-PCR检测骨髓间充质于细胞中α-SMA和Vimentin的表达,免疫荧光法签定骨髓间充质干细胞回输后在肿瘤组织中的分布及分化。 结果:第2代骨髓间充质干细胞经VX2培养上清诱导2周后,Cy3免疫荧光结果显示α-SMA和Vimentin呈强阳性表达,对照组呈弱阳性表达。与对照组比较,实验组α-SMA及Vimentin mRNA的表达水平均明显升高(P〈0.01,P〈0.05)。回输入VX2肿瘤组织3周后,骨髓间充质干细胞主要分布于肿瘤间质,其细胞核周围胞浆中α-SMA和Vimentin均呈强阳性表达,表明骨髓间充质干细胞在肿瘤组织中已分化为肌纤维母细胞。 结论:在肿瘤微环境的诱导下,骨髓间充质干细胞可以分化为肌纤维母细胞,从而促进肿瘤的生长与发展。
  • 构建人HCN4基因重组腺病毒载体及其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率 免费阅读 下载全文
  • 背景:超极化激活及环化核菅酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide—gated cation channel,HCN)基因由于具有不增加诱发心律失常的风险、能够接受自主神经系统调节等优势,成为目前最受关注的生物起搏备选基因。 目的:构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并测定其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率。 设计、时间及地点:细胞-基因学体外实验,于2008—02/09在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成。 材料:SD大鼠10只,由中山大学实验动物中心提供。携带目的基因人HCN4 cDNA的质粒pcDNA3.1-HCN4、人胚肾293细胞、大肠杆菌DH5a由中山大学附属第二医院林百欣实验中心保存。腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV、骨架质粒pAdxsi购自北京诺赛基因组研究中心有限公司。 方法:质粒pcDNA3.1-HCN4用Hind Ⅲ+XbaⅠ双酶切后回收HCN4片段,亚克隆至pShuttle—CMV中,得到重组穿梭质粒:I-Ceu Ⅰ+I.SceⅠ双酶切处理pShuttle-CMV-HCN4,回收CMV-HCN4片段,亚克隆至腺病毒骨架载体pAdxsi,得到重组腺病毒质粒;重组腺病毒质粒酶切线性化后,应用脂质体法转染293细胞进行包装扩增,得到重组腺病毒AdHCN4;应用AdHCN4转染大鼠骨髓间充质干细胞。 主要观察指标:重组腺病毒质粒载体的鉴定,重组腺病毒的鉴定及滴度测定,重组腺病毒的感染效率。 结果:构建的重组穿梭质粒pShuttle-CMV-HCN4用Hind Ⅲ+XhoⅠ双酶切,得到大小为3600bp(HCN4)和5100bp(pShuttle—CMV)两个片段,DNA测序结果证实人HCN4基因的全长序列已正确插入到pShuttle-CMV穿梭质粒中;重组腺病毒质粒pAdxsi-CMV-HCN4用XhoⅠ酶切得到7个片段,而作为对照的空腺病毒质粒只得到6个片段;重组腺病毒质粒在293细胞中包装后产生的重组腺病毒对293细胞有致病作用;重组腺病毒AdHCN4PCR鉴定可见657bp的阳性扩增条带;经多次重复感染后,病毒滴度检测达2.5×10^11PFU/mL。成功转染AdHCN4的大鼠骨髓间充质干细胞可表达绿色荧光蛋白,当病毒感染复数值为800,转染效率最高,达90%。 结论:实验成功构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并可在体外有效转染大鼠骨髓间充质干细胞。
  • 骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞后电生理特性的改变 免费阅读 下载全文
  • 背景:目前体外实验对骨髓间充质干细胞来源的神经元样细胞的研究多集中于形态学层面和神经标志物方面,对分化后的电生理功能研究较少。 目的:观察脑源性神经营养因子,碱性成纤维细胞生长因子,全反式维甲酸诱导Wistar大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞后电生理特性的变化。 设计、时间及地点:细胞学体外培养,对比观察,于2005—06/2007-10在天津市环湖医院细胞室和南开大学生命科学院完成。 材料:6周龄雄性Wistar大鼠3只,体质量160g左右。 方法:贴壁培养法体外分离纯化间充质干细胞,用脑源性神经营养因子,碱性成纤维细胞生长因子,全反式维甲酸联合诱导间充质干细胞向神经元样细胞分化。诱导前和诱导3d后分别用膜片钳技术检测细胞膜电流。 主要观察指标:流式细胞仪检测间充质干细胞表型;倒置显微镜观察诱导分化前后细胞形态变化;免疫细胞化学鉴定神经元特异性烯醇化酶的表达,以及全细胞电流测定结果。 结果:①流式细胞仪检测结果显示,CD90阳性率(99±3)%,CD31阳性率(3.4±0.8)%,CD34阳性率(0.3±0.1)%。说明这一细胞群大部分处于未分化的千细胞状态,其纯度可达95%。②光镜下可见未经诱导的间充质干细胞多为扁平形带突起的细胞,似纤维样细胞,诱导3d后出现神经元样细胞。③免疫细胞化学结果显示,诱导前间充质干细胞的神经元特异性烯醇化酶呈弱阳性,诱导后呈强阳性。诱导72h时分化率为(24.0±3.76)%。④诱导组神经元样细胞外向电流峰值及最大外向电流密度高于对照组(P〈0.05),但未发现内向钠电流。 结论:脑源性神经营养因子,碱性成纤维细胞生长因子,全反式维甲酸诱导方法可以诱导间充质干细胞向神经元方向分化,虽未发现具有成熟神经元电生理功能,但有向成熟神经元分化的趋势。
  • 人骨髓间充质干细胞的免疫调节作用及向神经元样细胞诱导分化 免费阅读 下载全文
  • 背景:骨髓间充质干细胞作为具有多向分化潜能的干细胞,属于未分化的前体干细胞,其表型分化尚不成熟,因此在同种异体移植后无排斥反应或反应较弱。但是在体外条件下通过化学和生物诱导物使骨髓间充质干细胞转化为神经元,影响骨髓间充质干细胞向神经细胞、胶质细胞系统定向分化的因素比较复杂。 目的:观察人骨髓间充质干细胞的免疫调节作用,及向神经元样细胞诱导分化的能力。 设计、时间及地点:对比观察,于2008-01/2009-03在无锡市第三人民医院细胞室完成。 材料:骨髓来源于人髋关节手术时的松质骨碎片或髂骨游离移植。 方法:首先分离和培养骨髓间充质干细胞,建立双向混合淋巴细胞反应体系,在双向混合淋巴细胞反应中,将来自2个志愿者的外周血单个核细胞(各1×10^5/孔)等比例加入96孔板中,根据不同效靶比E/Tratios(骨髓间充质于细胞/外周血单个核细胞)加入丝裂霉索处理过的骨髓间充质干细胞。在骨髓间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞实验中分别选择两种诱导培养基,方法1诱导:DMEM+体积分数为10%胎牛血清+1μmol/L全反式维甲酸+20μg/L碱性成纤维细胞生长因子+20μg/L表皮生长因子;方法2诱导:DMEM+2%二甲基亚砜+100μmol/L丁羟茴醚。 主要观察指标:^3H掺入法测定淋巴细胞增殖率,观察骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖的影响;通过条件培养基定向诱导,免疫荧光和免疫组织化学染色观察其分化为神经细胞的能力。 结果:①骨髓间充质干细胞与混合淋巴细胞反应体系共同培养抑制了淋巴细胞增殖,其增殖抑制率与加入骨髓间充质干细胞的数量呈正比。②方法1诱导2h后,光镜下可见骨髓间充质干细胞的细胞质向核收缩。呈典型核周体形态。3-5h后多数细胞能形成神经元样细胞形态,但细胞数目无明显增加。3d后大多数细胞转变为双极或多极神经元细胞样形态,部分细胞之间拉成网状。染色可见60%-70%神经元特异性烯醇化酶、45%-50%胶质纤维酸性蛋自阳性,巢蛋白阳性细胞下降为3.4%。方法2诱导2h即可见细胞体积变小,形成双极或多极的细胞体,可持续诱导48h,后大部分细胞浮起死亡。染色可见40%-50%神经元特异性烯醇化酶、35%-40%胶质纤维酸性蛋白阳性,巢蛋白阳性细胞在诱导2h时一过性上升到63%,48h时下降为1.6%。 结论:骨髓间充质干细胞具有向神经细胞分化能力并且可以抑制混合淋巴细胞反应体系中淋巴细胞的增殖,对同种异体免疫反应具有负调节作用。
  • 来源于骨髓、外周血与脐带血的间充质干细胞生物学特性比较 免费阅读 下载全文
  • 背景:间充质干细胞存在于人体多种组织,目前研究报道所用细胞来源单一,培养方法差异大,得出的结果不一致,不能证明分离、培养出的细胞是相同的细胞,难以比较。 目的:课题提出在体外培养条件下可对同一个体来源的骨髓、外周血来源间充质干细胞及不同个体脐带血来源间充质干细胞的生物学特性进行比较的理论假设。 设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007—06/2008—12在解放军海军总医院血液科完成。 材料:解放军海军总医院血液科造血干细胞移植供者10例,取同一供者的骨髓、外周血细胞,细胞体积分别为20mL与2mL。解放军海军总医院产科10例健康初产妇脐带血细胞,细胞体积为30mL。 方法:采用Percoll密度梯度+贴壁法分离骨髓、外周血、脐带血来源的间充质干细胞,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。当细胞生长汇合至80%-90%时胰蛋白酶-EDTA消化,制成5×10^8L^-1细胞悬液,计为P0。重复上述操作,即为P1,依此类推P2-P5。 主要观察指标:细胞生长形态观察,细胞瑞氏吉姆萨染包结果,细胞化学染色结果,细胞增殖数量,流武细胞仪检测细胞表面标记。 结果:①骨髓间充质干细胞贴壁时间、汇合至50%时间、汇合至80%时间均早于外周血、脐带血间充质干细胞;骨髓间充质干细胞培养5-7d时呈漩涡状生长,而外周血、脐带血间充质干细胞无此生长特性。②初始培养和传代培养后,骨髓间质干细胞多为成纤维样细胞,仪有少量内皮样细胞;而传至第5代的外周血、脐带血间充质干细胞除有成纤维样细胞外,还有较多的内皮样细胞和单核-噬样细胞。③P1-P5骨髓、外周血及脐带血来源间充质干细胞PAS染色、碱性磷酸酶染色、苏丹黑B染色均呈阴性。④与P0细胞比较,传代培养至P5后骨髓间充质干细胞增殖数量明显多于外周血、脐带血间充质干细胞(P〈0.05)。⑤CD29,CD44,CD90,CD71,CD105,CD166和HLA-ABC阳性率,骨髓间充质干纠胞接种后≤6%,P0-P5为55.9%-92.8%;外周血间充质干细胞接种后≤10%,P0~P5为19.7%-33.4%;脐带血间充质干细胞接种后≤20%,P0-P5为35.4%-93.2%。CD34,CD45和HLA-DR阳性率,3种米源的间充质干细胞均极低。CD14,CD31阳性率,骨髓间充质干细胞极低,外周血间充质千细胞为12.1%-28.3%,脐带血间充质干细胞为8.1%~21.3%。结论:结果显示在体外培养条件下,肯髓、外周血和脐带血均能较好地形成间充质干细胞,以骨髓来源的间充质干细胞含量最高,成分单一,而脐带血和外周血含鞋次之,细胞成分多。
  • 鼠龄对骨髓间充质干细胞生长特性和分化潜能的影响 免费阅读 下载全文
  • 背景:研究表明不同年龄的干细胞在体外增殖和分化特征存在很大差异,因此把握不同年龄阶段的骨髓间充质干细胞的生物学特点及向心肌细胞分化的能力,确定体外增殖分化的各种参数,对其临床应用至关重要。 目的:比较不同鼠龄骨髓间充质十细胞的体外增殖、表面标记及向心肌样细胞分化能力。 设计、时间及地点:细胞学体外对比观察,于2008—05/2009—05在山西医科大学生物化学与分子生物学实验审完成。 材料:健康wistar雄性大鼠15只,按鼠龄分为3组:幼年组鼠龄1个月,青年组鼠龄3个月,老年组鼠龄12个月,5只/组。 方法:采用全骨髓贴壁筛选法分离培养大鼠骨髓间充质千细胞,墩传至第3代细胞,加入5-氮胞苷向心肌样细胞诱导分化。 主要观察指标:MTT法观察细胞增殖特征,流式细胞仪榆测细胞表面标志,PT—PCR法测定诱导后心肌特异忡MHCmRNA的表达。 结果:各组骨髓间充质干细胞呈贴壁样生长,增殖曲线相似。存相同的培养条件下,幼年组和青年组的细胞增殖速度较老年组加快(F=28.71,P〈0.05)。各组第3代细胞均表达CD44,CD71,弱表达CD34,CD45,经5-氮胞苷诱导2周后,各组细胞均能表达心肌特异性MHC mRNA,但幼年组和青年组MHC mRNA的表达均明盟高于老年组(t=5.140,2.827,P〈0.05)。 结论:随着鼠龄的增加,大鼠骨髓间充质干细胞的增殖能力、存活时间和分化能力呈下降趋辨。
  • 白血病患儿骨髓间充质干细胞对K562/A02细胞增殖和凋亡的影响 免费阅读 下载全文
  • 背景:对白血病患儿在白血病细胞获得耐药、抗凋亡特性的过程中机制的研究目前甚少,多数研究集中在正常骨髓间充质干细胞和已建系的基质细胞,而未重视患儿骨髓间充质干细胞与白血病细胞之间的相瓦作用。 目的:课题创新性提出白血病患儿骨髓间充质干细胞可能对白血病细胞株K562/AO2生长增殖及凋亡产生影响的理论假设。 设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2007-12/2008—08在广州医学院第一附属医院儿科实验室完成。 材料:骨髓间充质干细胞来源于广州医学院第一附属医院住院的30例自血病患儿,其中急性淋巴细胞白血病患儿22例,急性粒细胞白血病8例,患儿家属对实验均签署知情同意书。K562/AO2细胞株由天津血液病研究所提供。 方法:Ficoll密度梯度法分离培养白血病患儿骨髓间充质干细胞。设立2组:K562/AO2细胞组单独悬浮培养处于对数生长期的K562/AO2细胞;K562/AO2细胞+骨髓间充质干细胞共培养组在骨髓间充质干细胞贴壁呈融合状态时,加入1×10^8L^-1处于对数生长期的K562/AO2细胞,24h后去除未黏附的K562/AO2细胞。 主要观察指标:白血病患儿骨髓间充质干细胞对K562/AO2细胞生长的影响,AnnexinV-FITC法榆测阿霉素对K562/AO2细胞凋亡的影响,流式细胞仪测定不同条件培养下的K562/AO2细胞周期,Taqman—MGB探针实时荧光定量PCR愉测不同条件培养下耐药基因mdr1的表达。 结果:与单独悬浮培养的K562/AO2细胞比较,K562/AO2细胞+骨髓间充质干细胞共培养组的K562/AO2细胞生长较为缓慢,无明显的对数生长期;早期凋亡细胞数明显减少(P〈0.05);处于G0-G1期的K562/AO2细胞明显增多,S期细胞减少:K562/AO2细胞mdr1耐约基因的表达无明显差异(P〉0.05)。 结论:体外细胞学实验结局证实,白血病患儿骨髓间充质干细胞诱导的K562/AO2细胞耐药与mdr1基因无关,而是通过黏附作用改变K562/AO2细胞周期,进而逃避药物的促凋亡作用。
  • 脐血间充质干细胞移植治疗多系统萎缩20例 免费阅读 下载全文
  • 目的:观察脐血间充质干细胞移植治疗帕金森墒患者神经功能的效果。 方法:选择2008—01/12北京和众华信治疗中心收治的帕金森病患者30例,均经过英国皇家医师学会帕金森病诊断与管理指南的帕金森病诊断标准确诊,男19例,女11例,年龄45-66岁,平均年龄58岁,Hoehn-Yahr分级为Ⅱ~Ⅳ级,患者对治疗均签署知情同意书,治疗方案经医院医学伦理委员会批准。所有患者均住院治疗,第1周进行常规检查,30例患者血、尿、便常规、肝肾功能、多项肿瘤标记物、胸片等均正常。自第2周起患者应用脐带血间充质干细胞进行鞘内注射移植治疗,以第3,4腰椎间隙为穿刺点,缓慢注入地塞米松2mg,取脐血间充质干细胞注射液5mL(干细胞数500万),在10min内缓慢注入蛛网膜下腔,1次/周,4次为1个疗程,共治疗1个疗程。采用帕金森病统一评分量表对患者移植前后神经功能进行评定,分位越高表示神经功能缺损越严重。 结果:30例患者均进入结果分析,中途无脱落。与移机前比较,30例患者移植后3个月帕金森病统一评分葡表分值均明显降低(P〈0.01),患者震颤、强直、运动迟缓、姿势不稳等临床症状均得到明照改善,均未出现移植物抗宿主病。 结论:脐血间充质干细胞移植可以一定程度地改善帕金森病患者的临床症状,提高患者生活质量。
  • 常用脊髓损伤模型与骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤 免费阅读 下载全文
  • 脊髓损伤的病理生理机制非常复杂,建立适宜的脊髓损伤模型,对模型进行骨髓间充质干细胞移植治疗,并分析其治疗脊髓损伤的机制,是进行临床脊髓损伤治疗的前提。目前常用的脊髓损伤模型包括挫伤型模型、牵张损伤模型、压迫损伤模型、切割或吸除型模型、缺血损伤模型等。常用的骨髓间充质干细胞移植方法有细胞悬液立体定位注射法、腰穿细胞悬液注射法、静脉内细胞悬液输入法等。骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤的机制可能有以下几方面:①骨髓间充质于细胞能向损伤处迁移,并向神绎细胞表型分化。②发挥桥梁介导作用。③骨髓间充质干细胞移植后能够抑制神经细胞的凋亡。大量动物实验结果证明,骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的临床应用前景是广阔的。
  • 造血干细胞移植在肝脏疾病治疗中的应用与进展 免费阅读 下载全文
  • 造血干细胞基本来源于骨髓、脐带血及外周血,而终末期肝脏疾病患者身体状况很差,几乎不能耐受较大的创伤,因此用外周血干细胞移植的方法来获得转分化后的肝细胞,是一种很有发展潜力的方法。外周血干细胞移植时如果要获取足够数量的干细胞,必须对外周血进行动员,目前干细胞动员剂分为3种类型:化疗药物、硫酸葡聚糖等聚阴离子制剂、各种重组的人造血细胞刺激因子。对于有着严重肝脏疾病的患者来说,选用各种重组的人造血细胞刺激因子是相对安全的。在造血干细胞的分离方法中,目前应用最广泛的是密度梯度离心法,它可以获得富含单个核细胞的白细胞层,从而初步富集CD34^+细胞。随着针对CD34^+不同抗原决定簇的单克降抗体的不断发现,准确、大量、快速阳性分选CD34^+细胞的免疫学技术也在迅速开展,如固相分选技术、流式细胞仪分选等。利用造血干细胞的高度增殖能力及多向分化潜能,对其进行体外扩增和定向诱导分化,从而在短时间内产生大量的早期造血祖细胞,以及定向扩增的多种细胞肝干细胞等而应用于移植,目前应用骨髓造血干细胞转分化为肝细胞己获得成功。为判断在移植器官中真正转分化的细胞是否来源于输注的干细胞,常在移植前对输入细胞进行标记,标记的方法包括荧光标记、特殊染色、基因标记、染色体鉴定等,然后应用免疫学和分子生物学、荧光化学技术加以检测。规阶段应用造血干细胞移植治疗肝脏疾病多为基础实验,临床上尚未得到广泛运用。
  • 神经干细胞植入阿尔茨海默病鼠脑后的效果观察 免费阅读 下载全文
  • 神经干细胞移植治疗阿尔茨海默病鼠包括细胞替代治疗和基因治疗,神经干细胞移植阿尔茨海默病鼠脑后其组织形态学与行为学效应均可以得到不同程度的修复和改善。细胞替代治疗中,神经干细胞与神经营养因子联合移植效应优于单纯的神经干细胞移植,但目前对神经干细胞体内分化机制的不确定导致了神经干细胞移植治疗的直目性,同时对影响其疗效的各种可能因素也缺乏比较研究。神经干细胞基因治疗具有细胞替代和基因治疗的双重作用,但尚处于研究的初期阶段,仍以NGF,BDNF,GDNF等单一营养因子基因修饰的神经千细胞移植治疗为主,且转基因神经干细胞移植入阿尔茨海默病鼠脑后外源基因表达效率、促分化、功能修复情况以及安全性的研究还很缺乏。目前神经干细胞移植治疗阿尔茨海默病鼠脑后的疗效检测技术手段比较单一,免疫组化方法与活体示踪技术的结合、形态学指标与功能学指标的综合检测是疗效检测的发展趋势。
  • 我的幸福概念 免费阅读 下载全文
  • 什么是幸福?对这古老的话题,近来有许多五花八门的网络调查。问题虽千变,大格却相差无几。 “工作单位稳定? 工资收入较好? 有大房有好车? 有当官的老公漂亮的妻子?”
  • [研究与报告]
    肝细胞生长因子与成纤维生长因子联合诱导人脐带间充质干细胞向肝样细胞的分化(朱华民 张洹)
    碱性成纤维细胞生长因子对人前脂肪细胞增殖和分化的影响(李卫华 孙志成 王文 李淑艳)
    食蟹猴神经干细胞的培养与分化
    不同供者来源及不同传代次数人脂肪间充质干细胞端粒酶的活性检测
    绿色荧光蛋白标记免骨髓间充质干细胞的成骨及成脂潜能(陈文坚 李锋 周松 陈安民)
    不同质量浓度时转化生长因子β1将如何诱导大鼠骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞的分化(陈谊 蔡文玮 盛净)
    上皮型钙粘蛋白在小鼠胚胎干细胞体外分化中动态表达及与细胞黏附状态关系
    钙黏蛋白11和核心结合因子α1双基因修饰人骨髓间充质干细胞
    羊水干细胞分泌细胞因子及其对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响(李宾公 郑泽琪 王梦洪 彭景添 施国祥)
    两步法分离和培养人羊水来源胚胎间充质干细胞的生物学特征
    高度同源性人脂肪间充质干细胞体外分离培养条件的优化
    平滑肌细胞纯化载体构建及在小鼠胚胎干细胞中的表达
    系统性红斑狼疮患者血清α干扰素和白细胞介素6共同作用对造血干细胞定向分化为树突状细胞的影响
    大鼠胚胎后肾间充质细胞体外标记的方法
    体外诱导分化多巴胺能神经元的分子特征(贡志刚 张荣俊 王晓东 兰青)
    人胚胎干细胞无血清无饲养层培养体系的建立
    构建免髓核细胞诱导人骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的体外模型
    昆明鼠胚胎干细胞系的建立及其特性(谢安 汪泱 娄远蕾 张立行 冯年花)
    [本刊特稿]
    学科新闻:Lhx2控制着干细胞向嗅觉皮质方向的分化
    让昨天告诉今天:2005年国际神经干细胞研究的学术与技术进展
    本期专题文章介绍:干细胞移植与心肌梗死
    干细胞医学词汇中英文对照
    医学英文句型正误辨析
    [信息导读]
    CRTER杂志“干细胞研究”栏目本月组稿重点
    [技术与方法]
    同种异体骨髓间充质干细胞移植急性心肌梗死大鼠缝隙连接蛋白43及缝隙连接蛋N45 mRNA的表达(赵艳梅 钟国强 李金轶 何燕 柯红红 王东旭)
    法舒地尔与骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤:有协同效应吗?(张建军 王东 刘泽朋 马景鑑)
    骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠肾脏辐射损伤(蒋玲 李真慧 娄琳 郭坤元)
    自体骨髓干细胞动员移植与手术移植治疗脊髓损伤的比较(李志营 步星耀 张圣旭 刘猛 程培训 张永福)
    脐带血清和成人自体血清体外培养人骨髓间充质干细胞的比较
    Y染色体原位杂交在追踪间充质干细胞上的应用(吴凤岚 周晓飞 曹巍 彭超 刘爱莲)
    改良小鼠骨髓间充质干细胞培养方法及长效荧光标记的可行性(王美华 胡锴勋 邱泽武)
    糖皮质激素对骨髓间充质细胞分化的影响
    兔骨髓间充质干细胞在肿瘤微环境诱导下向肌纤维母细胞的分化
    构建人HCN4基因重组腺病毒载体及其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率(袁桂仪 伍卫 周淑娴 张玉玲 雷娟)
    骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞后电生理特性的改变
    人骨髓间充质干细胞的免疫调节作用及向神经元样细胞诱导分化
    来源于骨髓、外周血与脐带血的间充质干细胞生物学特性比较
    鼠龄对骨髓间充质干细胞生长特性和分化潜能的影响
    白血病患儿骨髓间充质干细胞对K562/A02细胞增殖和凋亡的影响(邹亚伟 王昭霞 陈福雄 关镜明 卫凤桂 吴上志 何振涛 吴梓梁)
    [病例报告]
    脐血间充质干细胞移植治疗多系统萎缩20例(吴立克 王晓娟 许保磊 刘双双 褚赛纯 程波)
    [综述与专论]
    常用脊髓损伤模型与骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤
    造血干细胞移植在肝脏疾病治疗中的应用与进展(王亮 李梅君)
    神经干细胞植入阿尔茨海默病鼠脑后的效果观察

    我的幸福概念(王莉莎)
    《中国组织工程研究与临床康复》封面

    主管单位:中华人民共和国卫生部

    主办单位:中国康复医学会 《中国组织工程与临床康复》杂志社

    社  长:王莉莎

    主  编:刘昆

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