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文献检索:
  • 猪伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定及抗原差异性分析 免费阅读 收费下载
  • 2011年以来我国多个省份的规模化猪场发生了新生仔猪出现神经症状和死亡的现象,为确定其是否为猪伪狂犬病病毒(PRV)感染所引发,我们利用PCR方法从死亡的新生仔猪脑组织中扩增PRV的gE基因,发现被检猪场均存在PRV野毒感染。gE基因序列分析表明,从5个省14个猪场的病料中扩增的gE基因高度同源,与以往发表的相关序列比对显示,这些分离株均属于一个相对独立的分支。病料接种Vero细胞能够产生典型的细胞病变,将命名为PRV HeNl分离株接种小鼠能够引起瘙痒、死亡等伪狂犬病症状,并且对小鼠的LD50(10^2.37TCID50)显著低于经典强毒PRV双城株(10^3.83TCID50)。此外,中和试验结果显示,PRV Bartha k61活疫苗免疫猪仅能诱导对HeNl分离株低水平的中和抗体,而HeNl分离株能够诱导较高水平的中和抗体,并具有更强的交叉中和能力。根据本实验结果推测,近期各猪场流行的PRV可能存在一定的抗原变异。
  • 靶向O型口蹄疫病毒shRNA转基因猪体细胞抗病毒活性研究 免费阅读 收费下载
  • 为研究靶向O型口蹄疫病毒(FMDV)VPl基因shRNA转基因猪体细胞的抗病毒活性,本实验在成功培育转基因克隆猪的基础上,通过分离与培养转基因猪体细胞,对其shRNA进行PCR和Southern blot检测,并将FMDV感染体细胞中,通过细胞病变(CPE)、间接免疫荧光试验OFA)和实时荧光定量PCR(Real-timePCR)分析转基因猪体细胞抗FMDV活性。结果表明,转基因猪体细胞基因组DNA中携带有靶向FMDVVPl基因的shRNA基因片段。与非转基因猪体细胞相比,接种FMDV转基因猪体细胞其出现CPE的时间延迟,细胞内病毒含量显著降低,细胞感染病毒36h时,对细胞中FMDVVPl基因抑制效率为53.6%。表明该靶向FMDV shRNA转基因克隆猪体细胞在体外具有良好的抗病毒活性。本研究为进一步在体内评价转基因动物的抗病毒活性奠定了基础。
  • PRRSV XH-GD株Nsp2部分缺失感染性克隆的构建 免费阅读 收费下载
  • 为研究Nsp2编码区不同区域缺失对病毒体外复制的影响,本研究在猪繁殖与呼吸综合征病毒fPRRSV)XH-GD株反向遗传操作平台的基础上构建了pOK.AaBCD、pOK-AbBCD、pOK-AcBCD等3种Nsp2编码区部分缺失的感染性重组质粒。将这3种感染性质粒分别转染Marc-145细胞进行不同Nsp2缺失株的病毒拯救,结果显示,只有在Nsp2编码区缺失105个氨基酸的缺失株XH-GD-A105能够在Marc-145细胞中增殖,表明这一缺失区域为病毒复制的非必需,而其他两种感染性质粒则未拯救出相应的缺失重组病毒。本研究为进一步研究Nsp2的基因序列的缺失与PRRSV毒力之间的关系奠定了基础。
  • J亚群禽白血病病毒分离株HLJ09SH01株感染性克隆的构建及其致病性研究 免费阅读 收费下载
  • 为构建J亚群禽白血病病毒(ALV-J)分离株的感染性克隆并鉴定其对蛋鸡和肉鸡致病力的差异,本研究从黑龙江地区分离鉴定一株ALV-J分离株HLJ09SH01,以其核酸为模板,采用PCR方法分3段扩增其前病毒cDNA,PCR产物经克隆酶切后依次连接,获得一个含有完整ALV-J前病毒cDNA的重组质粒,命名为pBlue-HLJ09SH01。将其转染DF-1细胞,进行病毒拯救。通过间接免疫荧光、禽白血病抗原试剂盒检测及反转录酶活性试剂盒检验,表明拯救的病毒为ALV-J,命名为rHLJ09SH01。将其分别人工接种11日龄蛋鸡和肉鸡鸡胚,孵育出壳后隔离饲养32周。致瘤性试验结果表明,rHLJ09SH01可以导致57.9%的蛋鸡发生肿瘤,83.3%的肉鸡发生肿瘤。表明该感染性克隆具有亲本病毒的致病性。
  • 金黄色葡萄球菌毒力因子PSM-α的4个基因串联融合表达及其对人中性粒细胞的生物学作用 免费阅读 收费下载
  • 酚可溶性调控蛋白(PSM)是一种新发现的金黄色葡萄球菌(S,nureus)细胞外分泌蛋白,为研究其对人中性粒细胞的生物学作用,本研究通过设计linker将其中编码PSM-α蛋白的PSM-α1、PSM-α2、PSM-α3、PSM-α4基因串联,并克隆于pGEX-4T-1中。重组菌经IPTG诱导,重组蛋白以可溶形式高效表达。通过Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化并用凝血酶切除其GST标签,得到的蛋白作用于正常人的中性粒细胞,通过ELISA检测细胞因子IL-18及IL-8的含量。结果显示,纯化后蛋白刺激中性粒细胞后,IL-8含量显著升高。结果证明,串联表达后的PSM-α蛋白可以刺激中性粒细胞释放炎性因子,诱导炎症的发生,产生致病作用。
  • 产肠毒素大肠杆菌K88ab/K88ad菌毛操纵子fae全基因的克隆、表达及生物学活性的初步研究 免费阅读 收费下载
  • 为研究K88ab/K88ad菌毛对细胞的黏附作用,本研究分别以产肠毒素E.coil(ETEC) K88ab C83901株和K88adC83903株基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增这两种K88菌毛操纵予fae基因(均约7.9kb)。将其分别克隆于表达质粒pBR322中构建pBR-K88ab和pBR-K88ad重组质粒,并将其分别转化至不合任何菌毛的E.coli SES000株中。该重组菌能够分别与鼠抗K88菌毛阳性血清和抗K88菌毛单克隆抗体(MAb)产生凝集反应;在电镜下观察到重组菌表面大量表达K88菌毛。采用热抽提法提取其体外表达的K88ab和K88ad菌毛,SDS-PAGE电泳检测结果显示,菌毛蛋白的分子量约为26 ku。玻板凝集试验和westernblot结果表明:重组表达的K88ab及K88ad菌毛与K88+参考株菌毛均能够被抗K88菌毛阳性血清和MAb识别。以猪小肠上皮细胞系IPEC-J2为模型进行黏附和黏附抑制试验,结果表明表达K88菌毛的重组菌及K88+参考株均能够黏附于IPEC-J2上皮细胞表面;而且阳性血清和MAb能够有效抑制重组菌或K88+参考株对猪小肠上皮细胞系的黏附结合。
  • 牛乳样品中布鲁氏菌的分离和鉴定 免费阅读 收费下载
  • 为进一步改良布鲁氏菌(Brucella)分离和鉴定方法,本研究于2010年-2012年对新疆部分奶牛场进行Bmcella病的监测,采用改良Bmcella选择添加剂培养分离的方法,从试管凝集试验(SAT)检测阳性的25头奶牛的牛乳样中分离到9株分离菌,经VirB8-PCR方法扩增Bmcella的VirB8基因对分离株进行鉴定,结果表明9个分离株均为Bmcella。同时采用Bmcella分子分型PCR及生物学分型方法进一步对分离株鉴定,结果显示其中7个分离株为牛3型,另外2个分离株为羊3型。本研究为奶牛Bmcella病的检疫与防控提供了快速分离及鉴定方法。
  • 表达α-烯醇化酶重组腺病毒的构建及其在籽鹅卵泡颗粒细胞中的过表达 免费阅读 收费下载
  • 为构建表达籽鹅α-烯醇化酶(ENO1)基因的重组腺病毒,本研究利用RT-PCR技术,从籽鹅卵巢组织中扩增ENO1基因,克隆至pShuttle-CMV穿梭载体中,并利用I-CeuI与I-SceI将ENO1基因的表达框切下,连接到腺病毒骨架的pAdxsi载体中。采用PacI酶切,将其线性化,并转染至293(R)细胞进行病毒的包装,制备重组腺病毒。实验结果显示,制备的表达ENO1重组腺病毒的滴度达到1.1×10^11pfu/mL。将重组腺病毒感染籽鹅卵泡颗粒细胞后,荧光定量RT-PCR与western blot检测显示细胞中ENO1基因和蛋白表达水平显著高于正常细胞(p〈0.05),这些结果为研究ENO1生物学活性及功能奠定了基础。
  • 甲型H1N1流感病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立 免费阅读 收费下载
  • 为建立快速检测甲型H1N1流感病毒[Influenza A(H1N1)pdm09]的TaqMan荧光定量PCR方法,本研究根据甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因保守序列,设计并合成了特异性引物和TaqMan MGB探针,采用实时荧光定量PCR技术检测甲型H1N1流感病毒。使用含有选定检测序列的重组质粒pMD-HA标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.999,敏感性可达50TCID50。本研究中,甲型HINI流感病毒TaqMan荧光定量RT-PCR方法与经典H1N1、类禽H1N1、类人H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2流感病毒无交叉反应。结果表明,该方法可以在人类和动物间有效地检测甲型H1N1流感病毒。
  • 猪巨细胞病毒gB基因的原核表达与间接ELISA检测方法的建立 免费阅读 收费下载
  • 猪巨细胞病毒(PCMV)是引起新生仔猪死亡、鼻炎、肺炎和生长速度减缓的重要病原之一,我国尚无有效的诊断方法。为建立检测PCMV的ELISA方法,本研究以重组PCMV囊膜糖蛋白B(gB蛋白)为包被抗原,优化反应条件:抗原包被量0.4μg/mL,待检血清稀释度1:100,37℃包被2h后4℃过夜,5%脱脂乳37℃封闭2h,二抗1:10000稀释,37℃作用2h,抗体临界值为S/P≥0.354判为阳性,S/P≤0.295判为阴性,介于二者之间为可疑,建立了PCMV抗体间接ELISA检测方法。与猪瘟、猪伪狂犬病、猪附红细胞体病、副猪嗜血杆菌及猪圆环病毒2型等血清抗体无交叉反应,批间和批内重复性较好,对江苏省259份仔猪血清样品进行检测,抗体阳性率达56.76%,从而为PCMV检测和流行病学调查提供了有效方法。
  • 猪圆环病毒2型Cap蛋白与猪O型口蹄疫病毒VPl蛋白在杆状病毒中共表达及鉴定 免费阅读 收费下载
  • 为在真核细胞中共表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白与猪O型口蹄疫病毒(FMDV)VPl蛋白,本研究将其各自编码基因克隆于杆状病毒双表达载体(pFastBacTMDual)中构建重组转移质粒(pFBD-Cap-VPl),转化至DHl0BacTM感受态细胞中制备重组杆粒(rBacmid-Cap-VP1),并转染Sf21昆虫细胞,拯救出能够共表达PCV2-Cap和FMDV-VPl蛋白的重组杆状病毒(rBac-Cap-VPl)。SDS-PAGE和westernblot检测结果表明,共表达的重组PCV2-Cap和FMDV-VPl蛋白产物的分子量分别为28ku和30ku,各占总蛋白含量的11.6%和3.4%,能够分别与PCV2和FMDV抗体发生特异性反应,表明共表达蛋白具有良好的反应原性。本研究为PCV2和FMDV基因工程二联亚单位疫苗的研制奠定了基础。
  • 甲型H1N1(2009)流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与评价 免费阅读 收费下载
  • 自甲型HINl(2009)流感病毒于2009年在世界多个1N家暴发流行后,许多国家的猪群中检测到该病毒的存在,因此建立快速准确的甲型H1N1流感病毒的检测方法成为迫切需求。本研究针对甲型H1N1(2009)流感病毒NA基因设计特异性引物和探针,建立甲型H1N1(2009)流感病毒特异性实时荧光RT-PCR快速检测方法。并将该方法与WHO推荐美国CDC建立的检测方法和美国农业部推荐的检测方法进行比较。通过田间试验验证该方法在实际应用中的效果。结果表明:本研究建立的方法对检测甲型H1N1流感病毒裂解疫苗的灵敏度达到10^-6,与WHO推荐的A型流感病毒实时荧光PCR检测方法的灵敏度一致,并且高于美国农业部推荐方法的检测灵敏度(10^-5);该方法特异性强,与经典型H1N1和其他亚型流感病毒株无任何交叉反应。与香港兽医化验所进行了检测比对,检测灵敏度和特异性完全一致。近3800份的田间试验表明,所建立的方法准确可靠。本研究所建立检测方法快速灵敏,检测结果准确可靠,适合用于甲型H1N1(2009)流感病毒的分子生物学检测和监测。
  • 鸭疫里氏杆菌吉林分离株camp基因的克隆、表达及间接ELISA检测方法的建立 免费阅读 收费下载
  • 为建立鸭疫里氏杆菌(RA)的血清学快速检测方法,本研究根据GenBank中登录的camp基因序列设计引物,以吉林RA分离株JL-1的基因组DNA为模板,通过PCR扩增camp基因,并构建pET-camp重组表达质粒。转化至E.coli BL21(DE3)中诱导表达出分子量约为37ku重组蛋白,western blot分析结果表明该蛋白能够与血清1、2、10、11和17型RA全茵体阳性血清发生特异性反应。以纯化的重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA方法.结果显示其具有良好的特异性和重复性,与RA超声裂解抗原ELISA方法的符合率达到77.5%。研究结果进一步验证了Camp蛋白具有良好免疫原性,并且为RA多种血清型共同抗原,在RA的检测及亚单位疫苗开发中具有良好的应用价值。
  • 牛巴贝斯虫实时荧光PCR检测方法的建立 免费阅读 收费下载
  • 为建立牛巴贝斯虫(B.bovis)的TaqMan实时荧光PCR检测方法,本研究根据GenBank中B.bovis的18SrRNA基因保守序列,设计引物和TaqMan探针,通过优化反应体系,建立检测B.bovis的实时荧光PCR方法。试验结果表明:实时荧光PCR对靶基因的最低检测值为1.31×10^1copies/μL,比常规PCR的敏感性高1000倍;而且与牛的其他血液原虫无交叉反应;组内及组间重复性试验的变异系数均小于3%,具有良好的重复性;在23份被检样品中,实时荧光PCR和常规PCR的检出率分别为52.17%和30.43%。该检测方法的建立为B.bovis的检测提供了一种快速、敏感、特异的技术手段。
  • M细胞靶向肽对FaeG抗原的免疫增强作用 免费阅读 收费下载
  • 为研究M细胞靶向肽col的免疫增强作用,本研究从肠产毒素性大肠杆菌(ETEC)全基因组中扩增FaeG基因,通过重叠延伸PCR的方法将人工合成的col靶向肽编码序列连接到FaeG基因的3’端,获得FaeG-col融合基因。并分别将FaeG和FaeG-col基因克隆到pET-30b表达载体中,转化于大肠杆菌BL21(DE3)进行表达。SDS-PAGE和westernblot分析显示,FaeG和FaeG-col基因在大肠杆菌中均获得了高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在。分别用两种重组菌表达的包涵体免疫昆明鼠,测定特异性IgG、sIgA抗体水平,并用ETEC强毒株对免疫鼠进行攻毒。结果表明,FaeG-col重组蛋白免疫小鼠诱导机体产生的特异性IgG和slgA抗体水平均显著高于FaeG组;FaeG-col组两次免疫后即可对ETEC致死剂量的攻毒保护率达到100%。这些结果表明M细胞靶向肽对抗原具有免疫增强作用,是一种极具应用前景的免疫增强分子。
  • SPF雏鸡感染REV后IL-2mRNA表达的动态变化 免费阅读 收费下载
  • 为研究SPF鸡感染禽网状内皮组织增生症病毒(REV)后白细胞介素2(IL-2)mRNA表达的动态变化,本研究应用荧光定量RT-PCR方法,对SPF鸡感染REV后主要免疫器官的IL-2mRNA转录水平进行了初步研究。结果显示,与对照组相比,REV感染组鸡的脾脏、胸腺和法氏囊中IL-2基因的表达量在感染后7d、14d、21d、28d、35d、42d和49d均呈现升高,而且除21日龄、28日龄鸡的脾脏外,均为差异显著Co〈0.05)。本研究表明REV感染后可以诱导鸡的机体表达IL-2。
  • 鸭坦布苏病毒NSl基因的克隆及原核表达 免费阅读 收费下载
  • 为原核表达鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)NSl重组蛋白,本研究通过RT.PCR方法扩增NSl基因,将其亚克隆至pET32a(+)载体中构建重组表达质粒pET32a.NSl。将其转化大肠杆菌Rosetta中,经IPTG诱导表达了约59ku的重组蛋白。Westernblot分析表明,该重组蛋白可以与DTMUV阳性血清发生特异性反应,表明其具有良好的反应原性。
  • 一株基因Ⅶb亚型新城疫病毒F和HN基因的序列分析 免费阅读 收费下载
  • 为分析从某鹅病料样品中分离鉴定的一株新城疫病毒(NDV)(Goose/Foshan/2010)F和HN基因的序列特征,本研究采用RT.PCR方法扩增该病毒的F和HN基因的ORF序列,并进行序列测定。经序列比对、进化分析表明,Goose/Foshan/2010株属于基因VIIb亚型病毒株,F蛋白裂解位点序列为^112RRQKRF^117,HN蛋白由571个氨基酸残基组成,具有强毒株分子特征。对F和HN蛋白分析表明,其HN蛋白存在E347D和K495E两个点突变;此外,HN蛋白缺失了538位-540位的糖基化位点。该分离株为我国首次报道的鹅源基因Ⅶb亚型NDV分离株,与秘鲁及马来西亚早期基因Ⅶb亚型分离株进化关系密切,表明我国目前新城疫的流行情况十分复杂。
  • 鸡传染性支气管炎诊断方法研究进展及应用概况 免费阅读 收费下载
  • 鸡传染性支气管炎(Avian infectious bronchitis,IB)是由冠状病毒科冠状病毒属中的IB病毒(IBV)引起的鸡的一种急性高度接触性呼吸道传染病。该病首先由Schalk等于1931年在美国发现,我国于1972年由邝荣禄等首次在广东报道;目前该病呈世界性流行,是危害养禽业的重大传染病之一。
  • 疫苗佐剂的研究现状和发展趋势 免费阅读 收费下载
  • 疫苗佐剂是能够非特异性地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答、发挥辅助作用的一类物质。佐剂能够诱发机体产生长期、高效的特异性免疫反应,提高机体保护能力,同时又能减少免疫物质的用量,降低疫苗的生产成本。长期以来,传统疫苗(多为菌体或其裂解物)由于其免疫原性强,佐剂的研究和使用只局限于较小的范围,如毒素和类毒素。从巴斯德至今近百年来已开发了许多菌苗和疫苗,但传统的菌疫苗一般多为全细菌或全病毒制成,其中含有大量非免疫原性物质,这些物质除具有毒副作用外也具有佐剂作用。
  • [病原生物学]
    猪伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定及抗原差异性分析(彭金美[1] 安同庆[1] 赵鸿远[1] 刘益民[1] 陈家锃[1] 冷超粮[1] 孙艳[1] 常丹[1] 田志军[1] 童光志[2])
    靶向O型口蹄疫病毒shRNA转基因猪体细胞抗病毒活性研究(蔡扩军[1] 马钸委[1] 乔军[1] 孟庆玲[1] 陈创夫[1] 黄炯[2] 张再超[1] 杨海波[1])
    PRRSV XH-GD株Nsp2部分缺失感染性克隆的构建(张民泽 谢杰雄 郭泗虎 王衡 闫明菲 赵孟孟 黄震 粟硕 孙龙 张桂红)
    J亚群禽白血病病毒分离株HLJ09SH01株感染性克隆的构建及其致病性研究(纪晓琳 王琦 高玉龙 王永强 秦立廷 祁小乐 高宏雷 王笑梅)
    金黄色葡萄球菌毒力因子PSM-α的4个基因串联融合表达及其对人中性粒细胞的生物学作用(刘丽慧[1] 温峻[1] 袁鹏[2] 史祺云[2] 金琨琪[2] 程威[2] 于录[2] 冯海华[1])
    产肠毒素大肠杆菌K88ab/K88ad菌毛操纵子fae全基因的克隆、表达及生物学活性的初步研究(郁磊[1,2] 吴娟[1,3] 朱军[1] 朱国强[1])
    牛乳样品中布鲁氏菌的分离和鉴定(易新萍[1] 马晓菁[1] 闫晶华[2] 谷文喜[1] 刘丽娅[1] 叶锋[1] 吐尔洪·努尔[1] 钟旗[1])
    表达α-烯醇化酶重组腺病毒的构建及其在籽鹅卵泡颗粒细胞中的过表达(计红[1,2] 王江璐[1] 张伟宏[1] 郭景茹[1] 杨焕民[1] 柳巨雄[2] 李士泽[1] 孔凡志[1])
    [诊断和检测技术]
    甲型H1N1流感病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立(尹航[1,2] 杨焕良[1] 陈艳[1] 孟沙沙[1] 刘丽萍[1] 辛晓光[1] 陈化兰[1] 乔传玲[1])
    猪巨细胞病毒gB基因的原核表达与间接ELISA检测方法的建立(朱月华 刘捷 白娟 宋艳华 王先炜 姜平)
    猪圆环病毒2型Cap蛋白与猪O型口蹄疫病毒VPl蛋白在杆状病毒中共表达及鉴定(王一平 郭龙军 唐青海 刘丹 危艳武 李胜斌 刘建波 黄立平 吴洪丽 刘长明)
    甲型H1N1(2009)流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与评价(秦智锋[1,2,3] 张彩虹[1,2] 孙洁[1,3] 刘建利[1] 卢体康[1] 阮周曦[1] 林庆燕[1] 吕建强[1] 曹琛福[1] 曾少灵[1] 陈书琨[1] 廖立珊[1] 花群义[1])
    鸭疫里氏杆菌吉林分离株camp基因的克隆、表达及间接ELISA检测方法的建立(么乃全[1] 高云航[1] 于月[2] 张敏[3] 耿磊[1] 王全凯[1])
    牛巴贝斯虫实时荧光PCR检测方法的建立(刘启生[1] 王振宝[2] 王真[1] 哈森[2] 张玉婷[1] 巴音查汗[1])
    [免疫学]
    M细胞靶向肽对FaeG抗原的免疫增强作用(高菲 崔文 姜艳萍 唐丽杰 葛俊伟 李一经)
    SPF雏鸡感染REV后IL-2mRNA表达的动态变化(李恩扩 陈雪锋 孔斌 胡敬东)
    [研究简报]
    鸭坦布苏病毒NSl基因的克隆及原核表达(郭建伟[1,2] 董嘉文[2] 孙敏华[2] 李林林[2] 袁建峰[2] 吴玄光[1] 胡奇林[2])
    一株基因Ⅶb亚型新城疫病毒F和HN基因的序列分析(孙敏华 董嘉文 李林林 袁建丰 胡奇林)
    [综述]
    鸡传染性支气管炎诊断方法研究进展及应用概况(粟硕 张桂红)
    疫苗佐剂的研究现状和发展趋势(李娜[1,2] 周伟芳[3] 刘慧敏[2] 李赞[2] 仇华吉[1])
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