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  • 两株2．1d新基因亚型猪瘟病毒的全基因组序列分析及其基因亚型分子特征
  • 为研究猪瘟病毒（CSFV）2．1d新基因亚型的基因组特征，本研究根据GenBank中登录的zj0801株CSFV全基因组序列设计合成6对引物，通过RT-PCR方法对2014年分离自山东的两株2．1d亚型CSFV（SDSGl410和SDLSl410）进行全基因组测序，两株CSFV全长均为12296nt。全基因组遗传演化分析表明这两个分离株位于一个独立分支中，属于2．1d亚型，与E2基因分型结果一致。核苷酸和推导氨基酸同源性分析显示，分离株全基因组同源性与参考株相比差异较大，与zi0801株的全基因组同源性最高为97．3％～97．5％，而与1．1亚型的Shimen和HCLV株的同源性仅为85．0％～85．1％和84．3％～84．4％；部分基因和非翻译区变异较大，如Npro、C、E2、NS2、NS5A和3＇UTR。对全基因组氨基酸序列分析，结果显示2．1d亚型CSFV在V640、K992、A1020、Mt090、R1395和D2374 6处氨基酸上具有共同的分子特征。以上研究结果增加了CSFV2．1d新基因亚型的分型依据。
  • 大肠杆菌肽基脯氨酰顺反异构酶slyD基因缺失株的构建及生物学特性研究
  • 肽基脯氨酰顺反异构酶（PPIases）广泛存在于原核生物中，主要生物功能是专一性催化已磷酸化的丝／苏．脯氨酞顺／反异构。为研究大肠杆菌PPIasesslyD基因缺失对其生物学特性的影响，本研究利用改进的Red重组方法构建大肠杆菌BL21株的slyD缺失株，命名为BL21AslyD；并通过突变株的形态学变化、生长特性、生化代谢特性、耐酸性、耐渗透压能力、耐温度缺氧能力对其进行鉴定。结果表明，缺失株生长速率、耐高温缺氧能力与亲本株相比差异不显著，然而突变株的耐酸性与耐渗透压能力则显著低于亲本株（p〈0．01），表明大肠杆菌PPIasesslyD基因可能影响双组份调控系统的调节作用。本研究构建的大肠杆菌slyD基因缺失株BL21AslyD为进一步研究大肠杆菌slyD基因的功能奠定了基础。
  • 我国部分省份猪群中流感病毒血清学抗体的调查
  • 为了解近年来我国猪群中流感病毒的感染与流行情况，本研究分别对2013年11～12月期间采集于福建等9个重点养猪省份的2198份以及2014年3～4月期间采自于广东和湖南两省的3654份猪血清样品进行了血凝抑制（HI）抗体的检测。选取欧亚类禽型猪H1N1（EAH1N1）、2009甲型H1N1（2009／H1N1）、H3N2亚型猪流感病毒（SIV）、H5N1禽流感病毒（AIV）、H9N2AIV及H7N9流感病毒制备的HI标准抗原作为检测抗原。结果显示，2013年我国猪群中EAH1N1、2009／H1N1、H3N2SIV、H5N1AⅣ、H9N2AIV及H7N9流感病毒平均抗体阳性率分别为49，73％、11．87％、1．71％、0、0、1．36％：2014年分别为48。52％、12．10％、1．04％、0、0、2．05％。检测结果表明2013年～2014年间我国猪群中H1N1亚型SIV感染比较普遍，H3N2、H9N2流感病毒抗体阳性率较低，未检测到H5N1、H7N9流感病毒抗体。
  • 牛乳头状瘤病毒临床病理学检测及感染C127细胞研究
  • 为建立犊牛乳头状瘤病毒03PV）的实验室检测和体外感染C127细胞的方法，本研究通过光镜和电镜对牛乳头状瘤组织进行观察，采用PCR方法对瘤组织BPV进行检测，测序后确定其基因型。并将分离的BPV感染C127细胞，利用光镜观察细胞形态学变化，透射电镜观察C127细胞的病毒粒子分布。结果显示，光镜可见瘤体组织呈多个指状突起，每个突起的中心为纤维组织和血管，突起外为多层鳞状上皮细胞；异型性低，未见明显角化且无异常核分裂象。透射电镜观察可见基底细胞、棘细胞及颗粒细胞均出现细胞形状不规则、线粒体空泡状等病理变化。采用PCR方法检测到在约450bp处出现特异片段，测序结果显示该基N序列与分离自中国的BPV．2SW株（KC256805．1）L1基因的相似性高达99％，表明该病毒株为BPV．2型。利用BPV感染C127细胞经培养后可见细胞变小、细长、生长密集、排列紊乱等明显的形态变化。本研究结果表明牛乳头状瘤是由BPV．2感染引起的，并且BPV．2能够感染C127细胞，呈现出明显的形态学病理变化。
  • 产肠毒素大肠杆菌K88诱发BALB／c鼠肠炎模型的建立及评价
  • 为建立BALB／c小鼠感染产肠毒素大肠杆菌（ETEC）K88肠炎模型，本研究分别灌服小鼠浓度为1．0×10 9 cfu／mL、1．0×10 9cfu／mL和1．0×10 9cfu／mL的菌液，连续灌服3d，对其发病情况和外周血中各细胞因子水平进行检测。结果显示，灌菌后小鼠食欲下降、体重降低，外周血中IL-1仪、TNF-α以及髓过氧化物酶（MPO）含量增加，十二指肠病理组织切片显示炎症发生。灌茵期结束后第5d，小鼠粪便稀软，体重降到最低，所检测的细胞因子含量达到峰值，与对照组差异极显著（p〈0．05）；十二指肠肠黏膜层与肌层间隙增宽、杯状细胞增多、固有层与黏膜层炎性细胞侵润，炎症变化最为明显。本研究建立了BALB／c小鼠感染ETECK88肠炎模型，于灌菌期结束后第5d炎症最为严重。此外，接种不N浓度茵液的小鼠炎性因子数量变化差异不显著（p〉0．05）。
  • 无痕基因敲除技术构建鼠伤寒沙门菌luxS基因突变株
  • 为验证一种基于定点突变的无痕基因敲除技术（Scarless deletion）在鼠伤寒沙门菌中的有效性，本研究以鼠伤寒沙门菌中的luxS基因为靶基因，利用-Red重组酶和重叠延伸PCR（SOE-PCR）引入定点突变，以AAA代替luxS基因的起始密码ATG，改变luxS基因编码序列，通过测序验证并采用2型自诱导物（AI-2）试验检测是否有信号分子产生。基因测序结果显示luxS基因的起始密码ATG被引入的AAA代替；AI-2试验未检测到突变基因菌株的AI-2产物，而对照的野生菌株有AI-2产生，表明突变基因失活，方法有效。利用无痕基因敲除技术构建突变株简单快速，并且不影响被突变基因的另一条DNA单链序列，具有广泛的应用前景。
  • 鼠伤寒沙门菌sipB基因缺失对菌体糖酵解的影响
  • 为研究鼠伤寒沙门菌sipB基因编码蛋白与菌体糖酵解的关系，本研究对sipB基因缺失前后菌株丙酮酸、乳酸以及ATP含量进行检测，结果显示，sipB基因缺失后菌体丙酮酸、乳酸含量降低，而ATP含量升高，表明菌体糖酵解减弱，获取能量的方式发生改变。该结果为分析sipB基因编码蛋白与菌体糖酵解的关系，以及为研究sipB基因与菌体死亡的关系奠定基础。
  • 肠炎沙门菌延伸因子EF-Tu缺失株对环境压力的应答变化
  • 延伸热不稳定因子（EF—Tu）广泛存在于原核生物中，主要生物功能是在蛋白质合成过程中负责肽链的延伸。为研究肠炎沙门菌EF．Tu的tufA基因缺失对环境压力的应答变化，本研究利用改进的Red同源重组方法构建肠炎沙门氏菌SM6株的tufA缺失株，命名为SM6AtufA，并鉴定缺失株的形态学变化，分析耐酸性、渗透应力、温度缺氧应力、氧化应力的改变。结果表明缺失株对酸性条件及升温缺氧的耐受与亲本株相似；对渗透压的耐受稍强于亲本株，但差异不显著；对氧化压力的耐受显著弱于亲本株。本研究构建的肠炎沙门氏菌tufA基因缺失株SM6AtufA，为进一步研究EF-Tu在沙门氏菌的生物学和致病机制中的作用奠定了基础。
  • 二元调控系统中的TcfSR在布鲁菌胞内存活过程中的作用及其调控基因的转录分析
  • 为分析二元调控系统TcfSR在布鲁菌胞内存活中的调控作用，本研究采用同源重组和抗性替换的方法，利用卡那基因替换TcISR启动子，构建布鲁菌16M株的突变株16MATcfSR，并利用亲本株和突变株侵染小鼠巨噬细胞，比较两者在宿主细胞内的生存能力及其胞内存活相关毒力基因的转录情况。同时在各种逆环境下刺激亲本株和突变株，比较两者在逆环境中的存活能力。结果显示16MATcfSR在小鼠巨噬细胞和逆环境中的存活能力均比亲本株下降，并且突变株的胞内存活相关毒力基因的转录水平较亲本株具有差异。表明TcISR在布鲁菌胞内存活过程中具有重要的调控作用。本研究初步阐明了TCRSTcfSR的调控机制，为进一步研究TCRS在布鲁菌致病过程中的作用奠定了基础。
  • 一株虹鳟嗜冷益生菌Aeromonas popoffii的分离鉴定及体外抗病毒特性研究
  • 为分离鉴定冷水鱼类的益生菌，本研究从健康的冷水鱼虹鳟幼鱼的肠道、胆囊等部位分离得到75株嗜冷耐低温生长菌株，经过耐低温温度梯度筛选及体外抗菌试验初步筛选出一株虹鳟嗜冷益生菌株，经革兰氏染色及API50CH生化鉴定、16SrDNA测序比对，鉴定为Aeromonaspopoftii，将其命名为HL60分离株。通过耐胆酸游离酸试验、耐酸试验、体外抑菌试验和体外对鲤鱼上皮细胞（EPC）增殖影响试验及体外抗病毒（传染性造血器官坏死病病毒）试验，结果表明A．popoffii HL60分离株具有良好的益生特性及体外抗病毒活性。本研究分离获得的A．popoftiiHL60分离株为冷水鱼益生菌株活载体疫苗开发及应用奠定了基础。
  • 兔源金黄色葡萄球菌的耐药性及耐药基因分析
  • 为了解四川地区规模化兔场金黄色葡萄球菌（s．aureus）的耐药情况，本研究从四川地区部分规模化兔场共分离鉴定出41株S．aureus，采用纸片扩散法对分离株进行了耐药表型鉴定，同时采用PCR方法对相关耐药基因进行了检测。药敏试验结果显示：分离株对B．内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类和大环内脂类药物的耐药率分别为87．80％、97．56％、78．05％和56．10％，对多肽类、喹诺酮类及磺胺类耐药率较低。耐药基因检测结果显示：所有分离株均检9n,4到耐药基因，并且29株分离株具有多重耐药性，其中耐药基因mecA、tet、elm、aac（6′）／aph（2″）、ant（4′，4″）及aph（3′）-Ⅲ的检出率分别为75．61％、70．73％、46．34％、92．68％、80．49％及53．66％。结合耐药表型与耐药基因结果分析显示兔源S．aureus的耐药表型与耐药基因检出率基本呈正相关。本研究通过检测41株兔源S．atlreus对临床常用抗生素的耐药性及相关耐药基因，初步掌握了四川地区规模化兔场S．atlycus的耐药情况，为该地区规模化兔场预防及治疗葡萄球菌病临床合理用药提供了依据。
  • 泥鳅源霍乱弧菌的分离鉴定及药敏试验
  • 为探究引起江苏某渔场泥鳅发病死亡的病原，本研究对其病变组织进行细菌分离，获得一株优势生长细菌；通过对该菌株的形态观察、生理生化特性检测、16SrRNA基因测序比对及系统发育树聚类，结果表明该分离株为霍乱弧茵（V．cholerae），将其命名为BH-1；回归试验证实该茵为致病菌，能够导致健康泥鳅死亡；药敏试验结果表明该分离菌株对氨曲南、强力霉素、庆大霉素等29种药物高度敏感，对头孢唑啉、青霉素G、乙酰螺旋霉素等6种药物中度敏感，对苯唑西林、万古霉素、林可霉素等8种药物已产生耐药性。本研究确定霍乱弧菌BH-1为引起该渔场泥鳅大量死亡的病原．本研究结果为该病防治提供实验依据。
  • 河南中牟地区斑点叉尾鮰突发性败血症病原分离及鉴定
  • 为鉴定近期河南中牟地区斑点叉尾鮰突发性败血症的病原，本研究从患病濒死鱼中分离到3株致病菌并对其进行常规理化特性、分子生物学、病理学和致病性试验以及药敏性检测。结果显示，3株分离株理化特性与维氏气单胞菌（A．veronii）特征相符，与GenBank中登录的A．veronii的gyrB基因同源性达99％以上，在系统发育树上均与A．veronii聚为一族。病理学和致病性试验显示，病鱼鳃、肝、肾、脾、肠等组织器官具有典型病理变化，人工感染鱼出现与自然发病相似症状，并能够从发病鱼组织中再次分离到相同病原菌，以上结果表明3株分离株均为致病性A．veronii。药敏试验表明3株分离菌株均对氧氟沙星、氯霉素、多西环素3种药物敏感。本实验为中牟地区A．veronii的防治和自然感染A．veronii致病机理的研究奠定了基础。
  • 鸡粪中沙门氏菌和大肠杆菌O78多重PCR检测方法的建立
  • 为建立同时快速检测沙门氏菌和大肠杆菌078的方法，本研究根据沙门氏菌invA基因和大肠杆菌O78O-抗原特异基因序列设计引物，并在细菌16SrDNA区设计内参引物，通过各项参数调整优化，建立了能够直接从样品中同时检测沙门氏菌和大肠杆菌078的多重PCR检测方法。结果显示：该方法可以同时扩增出0781113bp和沙门氏菌821bp的特异片段以及细菌16SrDNA527bp的通用片段，而对于其他13种肠道致病菌只能扩增出527bp的细菌同源片段，具有较强的特异性。该体系检测沙门氏菌和大肠杆菌O78的最低检出限分别为103cfu／mL和102 cfia／mL。增菌5h，鸡粪模拟污染菌样品中沙门氏菌和大肠杆菌078的检测灵敏度分别为10 3cfu／mL和10 2cfu／mL。本研究建立的检测方法能够在8h内完成鸡粪样品中两种靶标菌的快速检测，对于沙门氏菌和大肠杆菌078的鉴别诊断和快速检测具有重大意义。
  • 猪呼肠孤病毒GD-1株σ1蛋白原核表达及其间接ELISA检测方法的建立
  • 为建立猪呼肠孤病毒（PRV）抗体间接ELISA检测方法，本研究采用PCR方法扩增PRVGD-1株σ1基因，并以原核系统表达其编码的σ1蛋白。以纯化的σ1蛋白作为包被抗原，鹅抗猪IgG-HRP为检测抗体，建立了PRV血清型3型间接ELISA血清学的检测方法。该方法对其他几种常见猪腹泻病毒均无交叉反应，具有较强的特异性。组内和组间变异系数均低于10％，重复性好。利用该方法和eBioscience同类ELISA进口抗体检测试剂盒对606份临床样品进行检测，两者符合率为96．2％。本研究建立的方法为进一步开发商品化试剂盒奠定了基础。
  • 表达抗鸡传染性法氏囊病病毒重组鸡源抗体CHO细胞的悬浮驯化
  • 为将贴壁生长的表达抗鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）重组鸡源抗体的CHO细胞株驯化为在无血清培养基中悬浮生长、高产的工程细胞株，本研究利用流式细胞仪筛选得到高产贴壁细胞株；以快速降低血清法进行驯化，使其适应悬浮培养，经过摇瓶无血清培养扩增，持续监测葡萄糖消耗情况，最终检测抗IBDV抗体的表达量。结果显示，悬浮驯化培养的CHO细胞能够在无血清培养基中稳定生长，生产周期短，接种密度为4．8×10^5 cells／mL，无血清单细胞悬浮培养120h后最大活细胞密度可达6．0×10^6 cells／mL，相同体积下抗体表达量较贴壁生长的高3倍，平均每个细胞每24h表达量达到15pg-20Pg。以上结果表明，贴壁生长的CHO细胞经过悬浮适应，不仅可以在无血清培养条件下快速生长，而且细胞对葡萄糖的利用率高，抗体表达量高。本研究筛选获得的细胞株节省了工艺生产中原料成本，操作方便，减少污染，易于放大，为工业化大批量生产奠定了基础。
  • 猪伪狂犬病毒gB、gC和gD蛋白多抗制备及交叉中和抗体效价测定
  • 为研究猪伪狂犬病毒（PRv）主要免疫原性基因的抗原变异情况，本研究构建了PRV变异株JS-2012和弱毒疫苗株Bartha—K61的gB、gc和gD基因重组真核表达质粒。通过基因枪途径免疫新西兰大白兔，对制备的兔源多克隆抗体进行交叉中和抗体效价的i／n,4定。结果显示，JS．2012和Bartha．K61株的gC蛋白和gD蛋白多抗对PRVJS．2012变异株、SC经典强毒株和Bartha．K61弱毒疫苗株的交叉中和效价均无显著差异；而两个病毒株的2B蛋白多抗对JS．2012和sc株的中和效价较低，分别为1：29．0～56．7和1：56．2～137．0，对Bartha—K61株以及其他毒力基因缺失弱毒疫苗株的中和效价较高，分别为1：75．0--490．0和1：198．6～986．9，差异显著，推测该结果可能与PRV毒力基因缺失有关。本研究为进一步鉴定PRV流行株的抗原变异奠定基础。
  • 杆菌肽锌对断奶獭兔盲肠菌群和免疫功能的影响
  • 为研究杆菌肽锌对断奶獭兔盲肠茵群和免疫功能的影响，本研究选用40只28日龄断奶獭兔，随机平均分为在基础日粮中添加杆菌肽锌（40mg／kg）的实验组和不添任何抗生素的对照组。采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR．DGGE）和荧光定量PCR（qPCR）方法对断奶獭兔盲肠菌群和TLR2、TLR4mRNA表达水平进行检测，ELISA对外周血细胞因子进行测定。PCR．DGGE结果表明，与对照组比较，实验组盲肠菌群丰富度、多样性和均匀度等均无显著变化（p〉0．05）。qPCR检测表明，实验组的梭菌类群XIVa显著降低（p〈0．0S）。在免疫功能调节方面，实验组外周血细胞因子IL-1、IL-2、IL-4、TNF-α的浓度显著升高（p〈0．05）；TLR2、TLR4mRNA的相对表达量总体呈上调趋势。以上结果表明，杆菌肽锌作为断奶獭兔饲料添加剂，对盲肠菌群结构没有显著影响，但能够增强机体免疫力。
  • 布鲁菌脂多糖的研究进展
  • 布鲁菌（Brucella）为革兰氏阴性胞内寄生菌，根据宿主偏爱性分为10个种，除经典的羊种、牛种、猪种、犬种、绵羊附睾种与沙林鼠种外，还包括新发现的从海洋哺乳动物分离到的鳍种和鲸种布鲁菌，以及从红狐狸和土壤中分离到的田鼠型布鲁菌和从乳房移植物中分离到的湖浪布鲁菌。布鲁菌可以感染包括人在内的多种哺乳动物引起布鲁菌病，对畜牧业生产、人类健康和公共卫生安全危害严重。

    • 《中国预防兽医学报》2016年第01期

    [病原生物学]
    两株2．1d新基因亚型猪瘟病毒的全基因组序列分析及其基因亚型分子特征(冯丽苹[1,2];张洪亮;彭金美;刘春晓;王倩;李真;吴桐;翁长江;蔡雪辉;田志军;熊涛)
    大肠杆菌肽基脯氨酰顺反异构酶slyD基因缺失株的构建及生物学特性研究(周薇[1,2];刘松艳;王曼宇;衣菲[1,2];田秋丰[1,2];陈志宝;刘思国;于申业)
    我国部分省份猪群中流感病毒血清学抗体的调查(隋金钰;杨大为;杨焕良;陈艳;许榜丰;尹航;乔传玲;陈化兰)
    牛乳头状瘤病毒临床病理学检测及感染C127细胞研究(姜晓文;权鑫;冯欣欣;马隽;魏庆微;于文会;张秀英)
    产肠毒素大肠杆菌K88诱发BALB／c鼠肠炎模型的建立及评价(齐宇;王开;伊淑帅;潘娜;胡桂学)
    无痕基因敲除技术构建鼠伤寒沙门菌luxS基因突变株(陈伟[1,2])
    鼠伤寒沙门菌sipB基因缺失对菌体糖酵解的影响(李静[1,2];陈松彪[1,2];张春杰[1,2];程相朝[1,2];李银聚[1,2];何雷[1,2];余祖华[1,2];颜云飞[1,2];刘慧[1,2];金二伟[1,2])
    肠炎沙门菌延伸因子EF-Tu缺失株对环境压力的应答变化(刘松艳;周薇[1,2];司微;王曼宇;张童利;刘思国;于申业)
    二元调控系统中的TcfSR在布鲁菌胞内存活过程中的作用及其调控基因的转录分析(李爽;李志强;张辉[1,2];付强;史慧君;李天森;王震;王勇;郭飞[2,3];王远志[2,3];张俊波;陈创夫[1,2])
    一株虹鳟嗜冷益生菌Aeromonas popoffii的分离鉴定及体外抗病毒特性研究(王宏磊[1,2];崔红玉;卢彤岩;徐黎明;刘淼;王云峰[2,4];王笑梅)
    兔源金黄色葡萄球菌的耐药性及耐药基因分析(邓钊宾;余滔;耿毅;汪开毓;坤清芳;邓梦玲;陈成;张雨薇)
    泥鳅源霍乱弧菌的分离鉴定及药敏试验(陈凯[1,2];梁利国;谢骏)
    河南中牟地区斑点叉尾鮰突发性败血症病原分离及鉴定(刘韬;王二龙;汪开毓[1,2];朱琳;何洁;段靖;李亚军;贺扬)
    [诊断和检测技术]
    鸡粪中沙门氏菌和大肠杆菌O78多重PCR检测方法的建立(胡茂秀;王莎莎;俞超)
    猪呼肠孤病毒GD-1株σ1蛋白原核表达及其间接ELISA检测方法的建立(刘启亮;戴益民;曹永长)
    [免疫学]
    表达抗鸡传染性法氏囊病病毒重组鸡源抗体CHO细胞的悬浮驯化(曹宏雪;郭笑辰;李婷婷;张胜奇;张瑛杰;刘鑫;任桂萍[1,2];尹杰超[1,2])
    猪伪狂犬病毒gB、gC和gD蛋白多抗制备及交叉中和抗体效价测定(刘飞;童武;梁超;杨莘;郑浩;童光志)
    杆菌肽锌对断奶獭兔盲肠菌群和免疫功能的影响(邹芙沁;文斌;孙豪;周毅;曾东;倪学勤;汪平;杨明月)
    [综述]
    布鲁菌脂多糖的研究进展(王小蕾[1,2];吴清民)
    《中国预防兽医学报》封面

    《中国预防兽医学报》往刊汇总

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    主办单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

    主　　编：孔宪刚

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    电　　话：0451-85935050

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    国际标准刊号：issn 1008-0589

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