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文献检索:
  • 聚合酶Ⅱ转录的sRNA与RNA沉默抑制子对TMV病毒载体表达系统作用的比较
  • 聚合酶Ⅱ介导合成的外源短链RNA(short RNA,s RNA)可以竞争性地抑制内源m RNA的核质转运,推测共表达s RNA可以间接地提高病毒载体表达系统的表达效率。为了验证这一假说和评价其应用潜能,本研究采用基因体外合成技术和亚克隆技术,分别构建了聚合酶Ⅱ转录的拟南芥U6-1 RNA和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)编码的RNA沉默抑制子(RNA silencing suppressors,RSSs)2b的植物表达载体。以农杆菌渗滤技术,与烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)表达载体共接种寄主植物本氏烟(Nicotiana benthamiana),通过对报告基因绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的荧光观察,并以Western blot和酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA)测定GFP在烟草中的表达情况,分析s RNA对植物病毒载体表达系统的作用和可能的作用机制。同时通过与RSSs比较,评价s RNA在植物生物反应器中的应用潜能。实验结果表明,聚合酶Ⅱ转录的s RNA能有效地提高TMV病毒载体介导的外源基因在植物中的表达(GFP表达量比对照组高约2.5倍),而且能够显著地降低TMV诱导的病程相关蛋白2(Pathogenesis-related protein 2,PR2)在细胞内的积累水平(PR2表达量比对照组下降约8倍)。推测Ⅱ型启动子转录的s RNA通过竞争性地抑制宿主抵御病毒入侵相关蛋白合成的m RNA核质运转促进病毒RNA介导的外源基因在植物中的表达。此外,Ⅱ型启动子转录的s RNA的作用效果与CMV病毒编码的RNA沉默抑制子2b相当。研究结果为提高病毒载体介导的外源基因在植物中的表达提供了一条可供借鉴的思路。
  • 副猪嗜血杆菌CDT毒素的生物学功能分析
  • 副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)是一种常见的猪(Susscrofa domestica)致病菌,其细胞致死性膨胀毒素(cytolethal distending toxin,CDT)被认为是一种重要的毒力因子,为进一步明确CDT的一些生物学及免疫学特性,本研究经体外组装获得了高纯度的CDT三聚体完整毒素,研究三聚体蛋白对Marc145及仔猪外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBLC)的毒性作用,明确CDT三个亚基的特异性抗体对其细胞毒性的阻断作用。原核表达的3个CDT亚基经过共折叠形成了稳定的三聚体蛋白,能诱导Marc145细胞产生典型的细胞病变。Cdt B及Cdt C的兔抗血清对CDT完整毒素具有中和作用,且Cdt C的兔抗血清可以更有效地阻断CDT的细胞毒性作用,最大中和效价为1∶16,而Cdt A亚基的兔抗血清无中和作用。CDT可以抑制丝裂原活化的仔猪PBLC增殖作用。致病菌株及非致病菌株分泌蛋白中CDT的滴度一致,均为1∶512。本研究结果表明,副猪嗜血杆菌CDT具有明显的免疫抑制作用,可能对于该菌在宿主体内定殖以及引起宿主系统感染至关重要,但并非造成不同菌株致病力显著差异的原因。本研究为揭示副猪嗜血杆菌的致病机理提供了重要信息。
  • OsEXPA8基因对水稻悬浮细胞的周期和大小的影响
  • 膨胀素是植物细胞特有的一种细胞壁松弛蛋白,在很大程度上决定着植物细胞的生长速率。α-膨胀素(α-expansin,EXPA)和β-膨胀素(β-expansin,EXPB)是植物膨胀素家族中两个较大的亚家族。水稻(Oryza sativa)中至少有34个α-膨胀素基因。本研究通过转基因技术,研究了一个水稻根特异性表达的α-膨胀素基因Os EXPA8对水稻悬浮细胞的细胞周期和细胞大小的影响。利用流式细胞仪,分析不同培养时期野生型和转基因型细胞周期的差异,结果发现,35S::Os EXPA8(过表达)转基因悬浮细胞大部分处于G2/M期,而Os EXPA8-RNAi(knock-down)转基因悬浮细胞多处在G1期;利用血球计数板测定细胞数量,结果表明,35S::Os EXPA8转基因细胞数量〉野生型细胞数量〉Os EXPA8-RNAi转基因细胞数量;利用显微镜测定不同培养时期的细胞大小,发现35S::Os EXPA8转基因细胞大小〉野生型细胞大小〉Os EXPA8-RNAi转基因细胞大小;测定愈伤组织块大小,发现35S::Os EXPA8转基因愈伤组织块大小〉野生型愈伤组织块大小〉Os EXPA8-RNAi转基因愈伤组织块大小。本研究结果表明,Os EXPA8能够促进水稻悬浮细胞的分裂和生长,从而增加细胞数量,增大细胞体积,对水稻悬浮细胞的生长具有调控作用。该研究将有助于更好地了解植物细胞壁的松弛过程,从而深入地认识植物的生长发育进程。同时,膨胀素作为一种细胞壁松弛因子在农业上具有潜在的生物工程应用价值。
  • 大白菜-结球甘蓝易位系AT4系列抽薹相关基因表达差异的cDNA-AFLP分析
  • 抽薹开花时间是大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)的重要性状,未熟抽薹直接影响大白菜的产量和品质。本研究以添加结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)4号染色体片段的大白菜-结球甘蓝易位系AT4系列为材料,结合抽薹性鉴定,获得了45株耐抽薹和15株易抽薹植株;利用c DNA-扩增片段长度多态性(c DNA-amplified fragment length polymorphism,c DNA-AFLP)技术,对不同春化处理的耐抽薹和易抽薹植株叶片差异表达片段进行分离,获得了126条与抽薹性相关的差异表达条带,这些差异包括条带的有无和表达量的差异;通过差异条带回收、克隆和测序,获得了74条差异表达序列。同源性比对结果表明,61条差异表达序列具有同源序列,其中41条差异表达序列功能预测涉及代谢、能量、细胞物质运输、信号转导、表达调控、DNA修饰、细胞周期等,20条差异表达序列功能未知;13条在NCBI中找不到同源序列,可能是一些新基因。本研究获得了耐抽薹大白菜-结球甘蓝易位系,为耐抽薹大白菜新品种的培育提供新材料;同时获得了耐抽薹和易抽薹材料间的差异表达序列,为获得影响大白菜抽薹性的关键基因,揭示大白菜抽薹开花机制提供支撑。
  • 猪转录因子Nanog高效表达、多克隆抗体制备及其应用
  • 多能转录因子Nanog可维持干细胞的自我更新和多向分化潜能。为深入研究猪(Sus scrofa)Nanog在多能性调控网络的作用,本研究制备了鼠抗猪源Nanog多克隆抗体。首先,从猪肾脏中克隆Nanog基因CDS,再将CDS连接到p ET32a质粒上,构建重组表达载体p ET32a-Nanog。将重组载体转化大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3),经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,优化最佳诱导时间、温度和IPTG浓度等表达条件,获得分子量为57 k D的Nanog重组蛋白。将纯化的Nanog蛋白,免疫C57BL/6小鼠(Mus musculus),6周后获得阳性抗血清,通过Western blot和免疫荧光检测其抗体效价及其特异性。结果显示,在28℃、8 mmol/L IPTG、诱导2.5 h的条件下,可获得高效Nanog重组表达;制备的鼠抗猪Nanog多克隆抗体能特异性识别猪诱导多能干细胞表达的Nanog蛋白。研究结果为猪多能性干细胞的研究提供了有力工具。
  • 葛根素对奶牛乳腺上皮细胞炎症模型中NF-κB信号通路的影响
  • 葛根素(puerarin,Pue)是从豆科植物葛根(Pueraria lobata)的根部提取的一种异黄酮,具抗炎作用。为探讨葛根素对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的奶牛(Bos taurus)乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,b MECs)炎症的抗炎机制,本研究通过胶原酶消化法培养原代的b MECs,采用免疫荧光法鉴定b MECs中特有标记物人细胞角蛋白18(cytokeratin-18,CK-18),Western blot检测β-酪蛋白(β-casein);细胞活力检测试剂盒(cell counting kit-8,CCΚ-8)筛选LPS刺激b MECs产生炎症反应的最佳浓度,酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞培养上清中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)的含量变化;将b MECs分成空白对照组、炎症模型组、葛根素药物组和地塞米松(dexamethasone,Dex)阳性对照组,用Western blot检测细胞中p-IκB-α、IκB-α、p-p65和p65蛋白的表达变化。研究发现,原代培养的细胞中存在特异性CΚ-18和β-casein,证明其为b MECs;经LPS刺激b MECs 24 h,炎症模型组细胞培养上清中TNF-α和IL-1β的含量比空白对照组显著升高(P〈0.05),证明b MECs炎症模型建立成功;葛根素处理组细胞中p-IκB-α蛋白较炎症模型组显著降低(P〈0.05),p-p65蛋白极显著降低(P〈0.01),且细胞培养液上清中TNF-α的含量极显著降低(P〈0.01),与地塞米松阳性对照组趋势一致,但两组无显著差异。结果表明,葛根素可通过抑制核转录因子(nuclear transcription factor-κappa B,NF-κB)信号通路的活化,降低其下游炎性因子TNF-α的表达,起到抗炎作用。本研究为临床上开发抗炎药物及治疗奶牛乳房炎打下了一定基础。
  • 绵羊PGRMC1蛋白的cDNA克隆、序列分析及组织表达
  • 孕激素受体膜组分1(progesterone receptor membrane component 1,PGRMC1)是膜相关孕激素受体蛋白家族成员之一,参与哺乳动物颗粒细胞和黄体细胞孕酮的抗凋亡过程,在促进卵母细胞成熟和维持卵巢机能方面具有重要作用。本研究通过RT-PCR对绵羊(Ovis aires)PGRMC1基因进行了克隆和组织表达谱分析,并利用实时荧光定量PCR对该基因在繁殖特性上存在明显差异的两个绵羊品种——多浪羊(常年发情)与中国美利奴羊(季节性繁殖)发情期和乏情期性腺轴组织的表达情况进行了检测。结果获得了绵羊PGRMC1基因部分c DNA序列(Gen Bank登录号:KM114208),其中编码区(Coding sequence,CDS)全长585 bp,编码194个氨基酸。其编码蛋白中包含一个Cyt-b5保守结构域。该基因在所检测绵羊各组织中广泛表达,其中以卵巢、子宫、肝脏、肾脏和下丘脑组织表达丰度较高。实时荧光定量PCR结果显示,同一绵羊品种发情期子宫、卵巢和松果体PGRMC1 m RNA水平均高于乏情期;不同绵羊品种间性腺轴组织基因表达水平存在一定差异,无论是发情期还是乏情期,多浪羊子宫、卵巢和松果体中PGRMC1 m RNA水平均高于同期的中国美利奴羊。本研究结果表明,PGRMC1在维持绵羊子宫与卵巢机能、调节激素分泌和发情行为等方面可能发挥重要作用。为进一步了解PGRMC1的生物学功能提供一定的理论依据。
  • 绵羊TSHR基因第10外显子T481C位点多态性分析
  • 促甲状腺激素受体(thyroid-stimulating hormone receptor,TSHR)在光周期介导的哺乳动物季节性繁殖过程中起着非常重要的作用,但在绵羊(Ovis aries)中的遗传特性与分子机制仍不明晰。本研究以筛选的绵羊TSHR基因第10外显子T481C位点SNP为候选分子标记,利用多聚酶链式反应-单链构象多态(polymerase chain reaction-single strand conformation polymerase,PCR-SSCP)技术,检测该位点在繁殖特性不同的阿勒泰羊、中国美利奴羊、萨福克羊、多浪羊以及湖羊和小尾寒羊群体中的多态性。结果表明,绵羊TSHR基因在第10外显子481 bp处发生了T-C突变,为同义突变,SSCP检测出3种基因型:TT、TC和CC,T481C位点的TT基因型在常年发情的湖羊、小尾寒羊和多浪羊群体中属于优势基因型,而在季节性繁殖的阿勒泰羊、萨福克羊和中国美利奴羊群体中比率最低,仅为8%;方差分析结果表明,常年发情的多浪羊、小尾寒羊和湖羊群体T481C位点的基因型频率与季节性繁殖的阿勒泰羊、萨福克羊和中国美利奴羊存在极显著差异(P〈0.01)。研究结果提示,绵羊TSHR基因第10外显子T481C位点多态性在常年发情与季节性繁殖绵羊群体中分布存在较大差异,该SNP可作为一个理想的分子标记应用于常年发情绵羊品种选育。
  • 犬BMSCs干细胞的分离培养及成骨诱导分化
  • 为了体外分离犬(Canis lupus)骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymai stem cells,BMSCs),并对其进行成骨诱导分化及鉴定,本研究用全骨髓贴壁法分离培养犬BMSCs,待细胞克隆成片后传代。在传代过程中,取不同代数的细胞进行生长曲线测定;取传至第2代(p2)细胞,对诱导前的细胞和成骨诱导分化10和21 d的细胞采用q RT-PCR鉴定性别决定基因相关转录因子2(SRY-related high-monility-group(HMG)-box protein-2,SOX2)、干细胞特异基因POU5f1转录因子4(octamer-binding transcription factor-4,OCT4)和NANOG 3个多能性干细胞标志基因及成骨细胞特异基因骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)和骨粘连蛋白(osteonectin,ONN)基因的表达;成骨诱导分化的细胞进行成骨细胞特异性指标碱性磷酸酯酶(alkaline phosphatase,ALP)、茜素红染色鉴定。结果表明,p5和p10细胞的生长曲线基本保持一致,而p20细胞的生长速度明显低于p5和p10。犬BMSCs表达OCT4和SOX2,但不表达NANOG;成骨细胞诱导10 d仍低水平表达OCT4和SOX2,但成骨细胞诱导21 d,不再表达OCT4和SOX2。随着诱导时间的延长,成骨细胞特异OCN和ONN基因的表达量增加。进行成骨诱导7 d后,ALP活性明显上升;成骨诱导10 d,未形成钙化结节;成骨诱导21 d,形成钙化结节,钙化结节被茜素红染成红色,随着诱导时间的延长,形成的钙化结节明显增多。证明犬BMSCs被成功地诱导为成熟的成骨细胞,可作为种子细胞用于兽医临床上犬的重症骨折、骨营养不良性关节病等疾病的治疗提供基础资料,为宠物犬临床疑难疾病的治疗开辟一条新途径。
  • CAST基因5'调控区的多态性与鸡肉质性状的关联性分析
  • 为探讨钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin,CAST)基因5'调控区的多态性与鸡肉质性状的关系,本研究以中国农业科学院家禽研究所选育的F、D、Y、B和S3等5个优质肉鸡(Gallus gallus)品系为试验素材,利用聚合酶链式反应限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)技术检测CAST基因的SNPs,并分析其多态性与肌肉p H值、维生素B1、肉色、系水力、肌内脂肪和肌纤维密度之间的关系。结果显示,在距CDS-198位点发现1个突变位点(G→A),G-198A位点检测到3种基因型GG、GA和AA,相关分析显示,AA基因型个体的肌内脂肪和肌纤维密度显著高于GG型和GA型个体(P〈0.05),而其他肉质性状无显著差异(P〉0.05)。由此可见,对于肉质性状而言,AA是最有利基因型,本研究结果初步表明CAST基因G-198A多态位点的A等位基因是提高鸡肉质性状的一个潜在的DNA标记。
  • 鸽子GR基因cDNA克隆与表达分析
  • 糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)是保守的核受体超家族中的一员,属于核转录因子,GR对维持机体稳态起着重要作用,同时在动物繁殖代谢过程中扮演着重要的角色。本研究旨在克隆鸽子(Columba livia domestica)GR基因的c DNA全长并分析其组织表达谱。参照鸡(Gallus gallus domesticus)的GR基因序列设计引物,利用RT-PCR和RACE技术,克隆得到了鸽子的GR基因的c DNA序列。测序结果表明,鸽子GR基因包含有2 313 bp的全长CDS序列,102 bp的5'UTR序列,以及18 bp的3'UTR序列,共编码770个氨基酸(Gen Bank登录号:NM_001037826.1)。通过序列同源性分析发现,鸽子GR氨基酸序列与鸡的同源性为94%,与短吻鳄(Alligator mississippienses)的同源性为85%,与人(Homo sapiens)的同源性为75%。通过与鸡、鳄鱼和人的氨基酸序列比对分析发现,鸽子的GR氨基酸序列中有一个非常保守的DNA结合区(DNA binding domain,DBD)和一个保守性较高的激素识别区(hormone recognition domain,LBD),此外还包括一个GR特异区域。利用q RT-PCR技术发现在鸽子不同组织中均有表达,表达量由高到低依次为睾丸、胰、肺、卵巢、腹部脂肪、肝、心、骨骼肌、肾、脾、输卵管、胃、下丘脑、大脑、肠和嗉囊。睾丸中表达量显著高于其他组织(P〈0.05),其次为胰腺和肺(P〈0.05),在嗉囊中的表达量显著低于其他各组(P〈0.05)。本研究获得鸽子GR基因c DNA全长、组织表达规律,为进一步研究鸽子GR基因的功能提供了基础资料。
  • 哲罗鲑精子冷冻保存
  • 哲罗鲑(Hucho taimen)是分布于额尔齐斯河和黑龙江等水域的冷水性珍稀鱼类,对其精子冷冻保存技术进行研究并建立精子冷冻库,对于哲罗鲑种质保存、人工繁殖发育、苗种培育及种群恢复都具有重要的意义。本研究利用生理盐水、葡萄糖、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)等配制了9种精子稀释液(MPRS,RS,Hanks,ELS,EG1,EG2,Stein,SS-2和D15),对哲罗鲑精子在稀释液中活力、加入抗冻剂后活力和液氮中冷冻后活力进行检测,发现精子在以上稀释液中均具较高活力(73.00±2.65)%~(96.67±2.08)%,加入二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)后活力下降,冷冻后仅在ELS和D15中具有极低活力(1.21±0.00)%和(1.1±0.00)%。进而利用ELS对甲醇、二甲基亚砜浓度进行筛选,发现精子在4%~12%甲醇中平衡20 min后活力仍为(79.00±6.52)%~(88.80±7.89)%,冷冻后仅在6%甲醇中具有相对较高活力(18.33±10.61)%,但与鲜精活力相比显著下降(P〈0.05)。精子在4%~12%DMSO中平衡5 min后精子活力为(43.75±11.09)%~(81.67±2.89)%,平衡20 min后精子活力极大下降(3.25±0.30)%~(45.00±5.77)%,冷冻后精子活力极低(1.00±0.00)%~(2.75±1.50)%(P〈0.05)。以D15为基础液对葡萄糖浓度进行筛选,发现当葡萄糖浓度为30%(D30)时,冷冻后精子活力相对较高(17.80±2.59)%,但与鲜精相比活力显著下降(P〈0.05)。另外对精子在D15、D30、Stein和ELs 4种稀释液中短期保存的效果进行比较表明,Stein中精子存活在时间最长(45 h),D30次之(15 h)。综上所述,分别在ELS和D30中加入6%甲醇冷冻保存哲罗鲑精子具有一定活力,本研究结果为哲罗鲑精子大量冷冻保存和精子库建立等方面研究奠定了基础。
  • 福建省青枯雷尔氏菌无毒基因组成及与致病力关系分析
  • 青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)致病力分化严重。为了解福建省青枯雷尔雷氏菌的致病力类型及与无毒基因组成关系,本研究以弱化指数为指标,对福建省内不同地区和寄主的63个青枯雷尔氏菌进行致病力测定,结果表明,供试的青枯雷尔氏菌可分为3种致病力类型:强致病力、过渡型和无致病力;进一步对供试菌株进行无毒基因avr A、pop P1和pop P2的检测,3个无毒基因分布频率不同,avr A基因分布频率最高,达79.37%,pop P1基因的分布频率最低为46.03%;不同寄主的菌株无毒基因组成不同,番茄(Lycopersicum esculentum)和辣椒(Capsicum annuum)寄主以分布3种和2种无毒基因为主,茄子(Solanum melongena)寄主主要分布2种无毒基因,花生(Arachis hypogaea)寄主的菌株无毒基因分布较少,只分布1种avr A基因或没有检测到无毒基因;不同地域的菌株无毒基因组成不同,以番茄寄主为例,建瓯玉山镇的菌株分布3种和2种无毒基因为主,分别占45.45%和31.82%,宁德屏南菌株中3个无毒基因均等分布,福州北峰菌株中只分布avr A和pop P2基因,二者均等分布,福州营口菌株中pop P2基因分布频率最高,达60.00%;不同致病力的菌株无毒基因组成不同,无致病力菌株分布3种和2种无毒基因为主,过渡型菌株分布2种无毒基因为主,而强致病力菌株分布1种无毒基因为主;青枯雷尔氏菌的无毒基因组成与致病力相关性分析表明,3个无毒基因分布均与致病力呈正相关,其中pop P1基因与菌株致病力相关性最高,达显著水平,其皮尔逊相关系数(Pearson correlation coefficient,PCC)值为0.31。本研究为植物青枯病预警和防控提供重要信息。
  • 代谢木糖的重组工业酿酒酵母构建及其乙醇发酵
  • 为了使工业酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)能直接利用木糖发酵乙醇,本研究设计带有kan MX和ura两种不同筛选标记的强启动子TPI的载体,并将启动子插入木酮糖激酶(xylulokinase gene,XKS1)及非氧化磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway,PPP)关键基因之前,并构建木糖异构酶基因(xylose isomerase gene,Xyl A)表达载体p YES2-FBA-xyl A,将该载体转入XKS1及PPP关键基因增强表达的重组菌株,Xyl A在工业酿酒酵母里成功表达,其活性为0.39 U/mg蛋白。q RT-PCR结果显示,XKS1及PPP四个关键基因TAL、RPE、RKI和TKL分别比出发菌株表达量提高4.08、1.62、3.98、17.36和4.17倍。重组菌株葡萄糖和木糖共发酵,重组菌株木糖代谢比原始菌株提高17.64%;研究结果表明,通过增强木糖代谢流关键基因的表达以及XI的表达,使工业酿酒酵母获得直接代谢木糖能力,这为工业酿酒酵母生产纤维素乙醇提供参考。
  • 水稻光温敏核不育的分子与表观调控机理
  • 两系法杂交水稻(Oryza sativa)的核心是光温敏核不育系,近年来对光温敏核不育系的研究取得了巨大进展。本文概述了光温敏雄性核不育基因的定位与克隆、育性转换机理、不育分子机制以及光温敏核不育的表观调控新进展,并对光温敏核不育的表观遗传学研究前景进行展望,以期为两系杂交水稻育种提供理论指导。
  • DHPLC技术鉴定玉米杂交种真实性及纯度
  • 变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术可用于检测玉米(Zea mays)品种的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)和插入/缺失(Insertion/Deletion,In Del)的多态性遗传标记。为验证DHPLC技术在玉米分子标记分析中应用的可行性和可靠性,本研究基于公共数据库中的玉米基因信息,筛选2条DNA序列作为目标分析片段,利用DHPLC技术平台对10份玉米杂交种及其亲本进行检测。2条目标分析片段的DHPLC分析结果显示,玉米杂交种产生的DHPLC谱图具有多态性,基于AmpⅠ片段,10份玉米杂交种产生3类DHPLC图谱,基于AmpⅡ片段,可产生7种图谱类型,不同类型的DHPLC图谱在峰的数量和峰的保留时间上存在明显差异。测序结果显示DHPLC谱型与基因型一一对应,即使只有一个碱基差异的两种基因型样本,也将产生不同峰型特征的DHPLC图谱。10份玉米杂交种中,除3份杂交种的两条目标片段的DHPLC峰型均一致以外,其余7份杂交种相互之间至少存在一个DHPLC谱型的差异从而可以获得有效区分。实验结果也显示所有杂交种均与其亲本混合样本的DHPLC图谱一致。利用该特征,可以认为通过比对玉米杂交种子和育种亲本混合样本的DHPLC图谱峰型,实现对杂交种子真实性和纯度的鉴定。DHPLC分辨率高、快速、操作简单、安全等优点,将是杂交玉米种子真伪和纯度快速鉴定的有效手段。
  • 甜瓜细菌性叶枯病菌胶体金ICA检测试纸条的研发与应用
  • 甜瓜(Cucumis melo)作物上会存在甜瓜细菌性叶枯病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymas)和瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)两种细菌病害,二者混合发生,症状极其相似,不易区分。为了快速、准确地在田间检测区分出两种病害,本研究利用甜瓜细菌性叶枯病菌单克隆抗体制备了免疫层析试纸条,并建立一种快速、简便地现场检测甜瓜细菌性叶枯病菌的胶体金免疫层析分析方法(immunochromatography assay,ICA)。在定性检测中,本方法对甜瓜细菌性叶枯病菌的定性检测限为2.5×103cfu/m L,与细菌性果斑病菌不存在交叉反应,具有很强的特异性。在半定量检测中,甜瓜细菌性叶枯病菌在2.5×103~1×105cfu/m L浓度范围内,T线和C线读数的比值与甜瓜细菌性叶枯病菌浓度的对数值呈显著的线性关系,线性方程y=0.392 2x-1.263 8,相关系数R2达到0.988 1。因此,本研究制备的快速、简便、经济的高特异性甜瓜细菌性叶枯病菌ICA是一种非常实用的检测方法,不仅可以在田间实时原地快速检测甜瓜细菌性叶枯病菌,同时还能与瓜类细菌性果斑病菌进行有效区分,为甜瓜等瓜类种植业的发展带来很大帮助。
  • 结合不对称PCR技术构建鸡NDV-IBV-ILTV联合检测基因芯片
  • 基因芯片(gene chip)是依据核酸杂交原理发展的一种生物新技术,在生命科学研究领域具有重要的应用价值。本研究将不对称PCR和基因芯片两种技术相结合,构建了同步检测鸡(Gallus gallus)传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)的共检基因芯片。分别选取ILTV的胸苷激酶(thymidine kinase,TK)和糖蛋白B(glycoproteins B,g B)基因、NDV的融合蛋白(fusion,F)和血凝素-神经氨酸酶蛋白(haemagglutinin-neuraminidase,HN)基因以及IBV的膜蛋白(membrane,M)和核衣壳(nucleocapsid,N)基因设计引物,从重组质粒菌中扩增制备探针基因,用乙醇沉淀法纯化后点制于氨基修饰的载玻片上,制备基因芯片;靶基因用cy3标记引物,进行不对称PCR扩增,扩增的荧光标记单链产物与芯片杂交。不对称PCR结果显示,当限制性引物与非限制性引物浓度比例在1∶10时ILTV-TK、NDV-HN和IBV-N的单链产物增加最多,当浓度比在1∶20时,ILTV-g B、NDV-F和IBV-M的单链产物增加最多;相应的标记样品与3种病毒检测芯片杂交后,均出现较强的杂交信号,而阴性对照检测不到荧光信号,灵敏性实验表明,当DNA浓度为1.8×104拷贝时杂交仍为阳性。本研究构建的诊断基因芯片对12份临床样品进行初步应用检测,与PCR检测技术检出率基本一致。本实验所建立的联合检测基因芯片能够快速、准确、高通量的诊断NDV-IBV-ILTV,可以应用于集约化养殖业中对多种鸡疫病病毒的检测。
  • 转座子介导细胞质显微注射技术的基因转移效率比较
  • 为了比较和探索SB(sleeping beauty)、PB(piggy Bac)和Tol2 3种转座子介导下的细胞质显微注射法在小鼠(Mus musculus)和斑马鱼(Danio rerio)上的转基因效率,本研究将包含3种转座子的重组载体p T3-PST-CAG-GFP分别与3种转座酶表达载体以1∶1质量比混合,显微注射至小鼠和斑马鱼受精卵细胞质,经体外培养后在胚胎发育不同时期用荧光显微镜检测报告基因绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性率,结果显示,在培养至4 Ed(96 h)(Ed:embryo day,胚胎发育的天数)的小鼠胚胎中,PB转座子介导的GFP转基因阳性率最高,达52%(N=281),显著高于SB的47%(N=328)和Tol2的36%(N=273)(P〈0.05);而受精后36和60 h(hour past fertilization,hpf)斑马鱼胚胎中,荧光显微镜检测表明,Tol2的GFP阳性率分别为36%(N=677)和37%(N=685),显著高于SB(28%N=691和27%N=708)和PB(30%N=687和32%N=675)(P〈0.05);转座子介导的细胞质显微注射可获得较高的转基因效率,且转座子活性具有物种差异性,在哺乳动物胚胎中PB转座子的基因转移效率最高,而在鱼类胚胎中Tol2转座子的基因转移效率最高。本研究为提高动物转基因效率研究提供重要参考资料。
  • [研究论文与报告]
    聚合酶Ⅱ转录的sRNA与RNA沉默抑制子对TMV病毒载体表达系统作用的比较(马婷[1,2];张西倩;丁向真;李志英[1,2];王盛[1,2])
    副猪嗜血杆菌CDT毒素的生物学功能分析(李军星;袁秀芳;徐丽华;王一成)
    OsEXPA8基因对水稻悬浮细胞的周期和大小的影响(郭尧敏;秦钟梁;张国鹏;金良;王贵学;黄俊丽)
    大白菜-结球甘蓝易位系AT4系列抽薹相关基因表达差异的cDNA-AFLP分析(许愿超;顾爱侠;轩淑欣;王彦华;赵建军;张巍巍;申书兴)
    猪转录因子Nanog高效表达、多克隆抗体制备及其应用(王传振;刘晓鹏;崔怡;王华岩)
    葛根素对奶牛乳腺上皮细胞炎症模型中NF-κB信号通路的影响(任婷婷;张东君;朱丽萍;杨文浩;曹荣峰;李华涛;田文儒)
    绵羊PGRMC1蛋白的cDNA克隆、序列分析及组织表达(高磊;沈敏;甘尚权;杨井泉;张译元)
    绵羊TSHR基因第10外显子T481C位点多态性分析(高磊;沈敏;赵赓;甘尚权;杨井泉)
    犬BMSCs干细胞的分离培养及成骨诱导分化(赵晓娥;魏强;李伟;何成军;张通明;马保华)
    CAST基因5'调控区的多态性与鸡肉质性状的关联性分析(李春苗;黎寿丰;赵振华;黄华云;王钱保;薛龙岗)
    鸽子GR基因cDNA克隆与表达分析(陶争荣;张昊;曾涛;董丽艳;周玮;李国勤;钟声亮;卢立志)
    哲罗鲑精子冷冻保存(田永胜;马允;解子牛;王位莹;罗志远;李胜忠;张俊杰)
    福建省青枯雷尔氏菌无毒基因组成及与致病力关系分析(郑雪芳;刘波;朱育菁)
    代谢木糖的重组工业酿酒酵母构建及其乙醇发酵(陈朝儒[1,2];王智;顿宝庆;张保明;李桂英;路明;杜风光;奚亚军)
    [研究评述与展望]
    水稻光温敏核不育的分子与表观调控机理(李超;徐建红)
    [研究资源与技术改进]
    DHPLC技术鉴定玉米杂交种真实性及纯度(彭梓;黄迎波;谭建锡;周慧平;袁小雅;王利兵)
    甜瓜细菌性叶枯病菌胶体金ICA检测试纸条的研发与应用(缪林玉;王利民;田艳丽;赵玉强;胡白石[1,3])
    结合不对称PCR技术构建鸡NDV-IBV-ILTV联合检测基因芯片(杨国淋;赵松;尹人杰;黄小波;马锐;张仙;曹三杰;文翼平;伍锐;文心田)
    转座子介导细胞质显微注射技术的基因转移效率比较(薛松磊[1,2];史云强;陈才;沈丹;李庆平;宋成义[1,2];崔恒宓[1,2];高波[1,2])
    《农业生物技术学报》封面

    主管单位:农业生物技术学院

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