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文献检索:
  • Ⅰ-E型CRISPR/Cas系统介导适应性免疫分子机制研究进展
  • 为了更好地适应环境,原核生物可通过水平基因转移的方式获取外源基因(来自噬菌体、质粒或其他物种基因组)。在获取外源基因的同时,原核生物也面临着"自私基因"入侵的风险。因此,原核生物需建立相应的机制选择性地摄取或降解外源DNA,从而防范基因转移带来的潜在危害。近年来,人们在原核生物中发现了由小RNA介导降解DNA的防御外源基因入侵的适应性免疫。在免疫防御过程中,首先外源DNA部分片段整合至细胞自身基因组上成簇出现的重复序列(CRISPR)上;然后表达并加工成熟的CRISPR RNA和相关Cas蛋白形成CRISPR/Cas复合体降解再次入侵的外源DNA。本文在简介CRISPR/Cas系统的基础上,重点探讨近年来关于大肠杆菌中I-E型CRISPR/Cas系统作用机制和调控机制的研究进展。
  • 厌氧氨氧化体的组成、结构与功能
  • 厌氧氨氧化(Anammox)是微生物和环境领域的研究热点之一。厌氧氨氧化菌(AnAOB)是Anammox的功能载体。不同于大部分原核微生物,AnAOB具有独特的细胞器——厌氧氨氧化体,它是进行Anammox代谢的场所。研究厌氧氨氧化体有助于探明厌氧氨氧化菌的代谢特性。本文综述了厌氧氨氧化体的组成、结构与功能,以期为从事Anammox研究的同行提供参考。
  • Epstein-Barr病毒的免疫调控与逃逸机制
  • EB病毒(Epstein-Barr Virus,EBV)属于γ疱疹病毒科,是第一个被发现与人类肿瘤相关的DNA病毒。EB病毒通过激活Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)信号通路,诱导I型干扰素的大量释放和功能性的自噬机制,从而引起机体的免疫应答。然而,相对于其他疱疹病毒,EB病毒已进化出更为精细且错综复杂的机制来破坏和逃逸宿主的免疫系统,如限制自身蛋白表达、活化宿主的泛素-蛋白酶体系统、干扰或逆转自噬与泛素化修饰等。这些机制会引发EB病毒在宿主体内的持续性感染,导致宿主免疫功能失调,引发EB病毒相关疾病(如鼻咽癌、传染性单核细胞增多症等)。因此,研究EB病毒特异性的免疫调控机制不仅对深入理解EB病毒的潜伏性感染和致癌性至关重要,而且还将为EB病毒诱发的相关疾病的免疫预防与治疗鉴定出新的潜在靶点。此文主要阐述了EB病毒调控宿主免疫应答和逃逸先天免疫应答的分子机制。
  • 丛枝菌根真菌脂类代谢对共生信号调控的响应和反馈
  • 丛枝菌根(AM)真菌是自然生态系统中分布最为广泛的真菌之一,在自然界物质循环和能量流动中发挥着重要作用。经过长期的协同进化,AM真菌和宿主植物之间形成了完美的互惠互利的共生关系,而真菌的脂类代谢可能是揭示共生秘密的关键所在。本文综述了AM真菌脂类代谢在共生关系建立和维持中关键作用的最新研究进展,重点探讨了AM真菌脂类代谢对共生信号调控的响应和反馈机制,主要包括:AM真菌脂类存储和释放对共生和非共生状态的响应,以及脂类代谢产物变化与共生营养传递之间的关系;脂类分解过程在共生建立初期对信号分子调控发生的响应,以及相应的物质转化和能量代谢;菌根共生互惠互利关系维持中,真菌脂类代谢与信号分子交流通道的相互渗透和影响。本文对于理解菌根共生机制,促进菌根在生产中的应用具有促进作用。
  • 近20年中国部分地区鸡源H9N2亚型禽流感病毒HA基因遗传演化及其变异频率
  • 【目的】通过比较不同时期的H9N2亚型禽流感流行毒株HA基因的分子特征和变异频率,揭示免疫压力下病毒的遗传演化趋势。【方法】选取源于课题组的40株鸡源H9N2毒株,以及从Gen Bank下载的136株中国鸡源H9N2流行毒株和7株经典毒株的序列,利用Lasergen 7.1和MEGA 5.1等软件,对其HA基因进行系统演化、分子特征和变异频率分析。【结果】系统发育分析表明,近20年的鸡源H9N2流行株分属于BJ94、Y280和S2等谱系,优势流行株的分布与年代密切相关。氨基酸序列比较显示,H9N2病毒不同谱系之间具有各自的特征,且存在着明显的氨基酸变异积累。以Ck/BJ/1/1994 HA基因为参照,1994–2014年间,H9N2流行株核苷酸和氨基酸的年均进化率分别为5.73×10^–3和4.25×10^–3。其中,2011–2014年的核苷酸(氨基酸)年均进化率为6.35×10^–3(5.32×10^–3),明显高于2006–2010年5.22×10^–3(3.70×10^–3),更显著高于疫苗推广初期1999–2005年的0.74×10^–3(0.50×10^–3)。【结论】H9N2疫苗株和流行毒株的不匹配是病毒变异频率加快的重要原因。
  • 产L-天冬氨酸α-脱羧酶细菌的分离、鉴定及发酵条件优化
  • 【目的】从葡萄园土壤中分离L-天冬氨酸α-脱羧酶的产生菌株,对其进行分类鉴定,优化其产生L-天冬氨酸α-脱羧酶的发酵条件,为β-丙氨酸的生物合成提供基础。【方法】采用变色圈法和液体复筛培养基分离筛选具有L-天冬氨酸α-脱羧酶活力的菌株,对菌株进行形态、生理生化特征试验及16S r RNA序列同源性分析鉴定菌株的系统发育学地位,采用单因素及正交设计试验优化培养基及发酵条件。【结果】筛选到一株L-天冬氨酸α-脱羧酶高产菌株Pan D37,其亲缘关系和特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)较近,且形态与培养特征、生理生化特性与特基拉芽孢杆菌基本相符。研究表明其最佳发酵配方和培养条件为:蔗糖22.5 g/L、富马酸7.5 g/L、蛋白胨20 g/L、L-天冬氨酸6 g/L、Triton X-100 2g/L,起始p H为7.0,装液量50 m L/500 m L,摇床转速220 r/min,种子液接种量为5%(V/V),35°C培养28h。在最优条件下L-天冬氨酸α-脱羧酶活力可达44.57 U/m L,比初筛时提高2.57倍。【结论】分离并获得一株特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)Pan D37,经条件优化后具有较高的L-天冬氨酸α-脱羧酶产生能力,有望应用于β-丙氨酸的工业生产。
  • 关键基因的修饰对枯草芽孢杆菌尿苷合成的影响
  • 【目的】探究磷酸核糖焦磷酸(PRPP)合成酶(prs)和氨甲酰磷酸合成酶(pyr AA/pyr AB)的点突变,以及异源5′-核苷酸酶(sdt1)的过表达,对枯草芽孢杆菌尿苷生物合成的影响。【方法】依据推断的变构位点,分别在prs基因和pyr AB基因编码序列中引入点突变;将点突变的prs基因在染色体xyl R位点整合表达,pyr AB基因则在染色体原位被修饰;sdt1基因在染色体sac B位点整合过表达。通过对重组菌摇瓶发酵液中尿苷、胞苷和尿嘧啶的分析,表征相关基因修饰对尿苷合成的影响。【结果】在PRPP合成酶中引入Asn120Ser、Leu135Ile和Glu52Gly或Val312Ala点突变,分别导致尿苷积累量提高67%和96%。进一步在氨甲酰磷酸合成酶中引入Ser948Phe、Thr977Ala和Lys993Ile点突变,导致尿苷积累量又增加了182%,达到6.97 g/L。在此基础上,过表达异源5′-核苷酸酶,导致尿苷产量增加17%,达到8.16 g/L。【结论】PRPP合成酶和氨甲酰磷酸合成酶的酶活或反馈抑制调节机制,是限制尿苷过量合成的重要因素。PRPP合成酶的Asn120Ser和Leu135Ile点突变,以及氨甲酰磷酸合成酶的Ser948Phe、Thr977Ala和Lys993Ile点突变,能够显著促进尿苷合成。PRPP合成酶附加的Glu52Gly或Val312Ala点突变,有利于尿苷合成。异源的嘧啶专一性5′-核苷酸酶的引入,也对尿苷的合成有明显的促进作用。
  • 长双歧杆菌N-乙酰氨基己糖1-位激酶的活性位点
  • 【目的】研究长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)JCM1217的N-乙酰氨基己糖1-位激酶(Nacetylhexosamine 1-kinase,Nah K)中对催化活性有影响的位点。【方法】利用点突变试剂盒,获得Nah K的4个位点的共10种单点突变体表达菌株。诱导表达并纯化野生型和突变体酶,用DNS法和NADH偶联的微孔板分光光度法检测野生型及突变体酶的最适p H和最适Mg~(2+)浓度,并测定酶促反应动力学参数。【结果】D208A、D208N、D208E和I24A四种突变体的催化活性几乎丧失。突变体H31A、H31V、F247A和I24V的最适p H由野生型的7.5变为7.0,突变体H31A和F247A的最适Mg~(2+)浓度由野生型的5 mmol/L变为10 mmol/L。反应动力学参数测定结果表明,突变体F247Y对底物Glc NAc/Gal NAc及ATP的催化活性均高于野生型。【结论】通过定点突变,确定了对Nah K催化活性有影响的4个位点,并且获得了一个催化效率提高的突变体(F247Y),为进一步对Nah K进行分子改造奠定了一定基础。
  • 小鼠体内SEG蛋白靶向运送shRNA抑制狂犬病毒复制
  • 【目的】本试验前期已经证实,用单链抗体(sc Fv)-绿脓杆菌跨膜区(ETA)-酵母DNA结合结构域(GAL4)表达的蛋白(简写为SEG蛋白),SEG能与含sh RNA(short hairpin RNA)的质粒(p RNATU6.3-sh RNA)结合形成复合物SEG-sh RNA,并靶向运送该质粒进入感染狂犬病毒(Rabies virus,RV)的细胞,抑制RV复制。本研究用感染狂犬病病毒的小鼠模型,进行SEG-sh RNA复合物小鼠体内靶向性运送si RNA(short interfering RNA)和抑制RV复制的研究。【方法】用已建立RV CVS-24株小鼠肌肉注射模型进行试验。取50 LD_(50) CVS-24攻毒,在攻毒后12 h尾静脉注射SEG-sh RNA,流式细胞仪检测SEG-sh RNA的体内靶向性;同样方法攻毒后,尾静脉注射SEG-sh RNA,连续4 d,攻毒后第5天小鼠脑组织用q RT-PCR、RT-PCR、Western blot、免疫荧光染色法检测其中RV的含量;统计小鼠存活率;并检测小鼠体内IFN-α含量,从而分析SEG-sh RNA在体内的抗病毒作用。【结果】结果表明仅在RV攻毒小鼠的注射部位检测到绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达,未注射RV的腿部及脑、肝、脾、肾均无GFP表达,说明SEG-sh RNA可靶向RV感染细胞运送sh RNA。攻毒后第5天脑组织q RT-PCR结果表明靶向药物组比病毒对照减少4.88倍(3.9/0.8);RT-PCR、Western blot、免疫荧光染色试验结果表明使用SEG-sh RNA组病毒量明显少于病毒对照组;且攻毒后13 d,动物存活率达50%,而病毒对照100%死亡。检测小鼠体内IFN-α未见升高。【结论】以上试验表明SEG蛋白在小鼠体内靶向运送含sh RNA的质粒到感染组织细胞;对小鼠体内RV有明显抑制作用,因此可以用于狂犬病毒感染的特异辅助性救治研究。
  • 南大西洋深海热液区可培养硫氧化微生物多样性及其硫氧化特性
  • 【目的】探索南大西洋热液环境中的硫氧化细菌多样性并研究其硫氧化特性。【方法】通过富集培养和分离纯化获得硫氧化细菌,利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析富集菌群组成结构,采用离子色谱法对获得的硫氧化细菌硫氧化特性进行检测。【结果】从南大西洋深海环境样品中共分离到48株菌,分属于alpha-Proteobacteria(28株,58.3%)、Actinobacteria(11株,22.9%)和gama-Proteobacteria(9株,18.8%)共3个门,其中Thalassospira、Martelella和Microbacterium为优势属。DGGE结果表明深海热液环境样品中微生物多样性丰富且不同站位存在差异。硫氧化特性研究结果表明,约60%的分离菌株具有硫氧化能力,可以氧化S_2O_3~(2–)生成SO_4~(2–)。获得一株硫氧化能力较强的潜在新种L6M1-5,在实验条件下可高效氧化S_2O_3~(2–),最大氧化速率可达0.56 mmol/(L·h)。【结论】南大西洋深海热液环境中可培养硫氧化细菌多样性丰富,为研究热液环境中的硫循环过程提供了实验材料和理论参考;同时高效硫氧化菌的获得,为工业化含硫废水的处理提供了良好的菌种资源。
  • X射线对我国两种典型土壤中微生物活性及群落结构的影响
  • 【目的】X射线断层扫描技术(X-ray micro-Computed Tomography,micro-CT)能够原位、无损伤的解析土壤物理结构,有望与土壤微生物研究结合,以有助于更好的了解土壤生态系统。由于土壤的高度异质性,X射线扫描和土壤微生物分析应为同一样品,但是关于X射线扫描后的土壤样品是否兼容土壤微生物分析却鲜有报道,即X射线扫描是否影响土壤微生物的活性及群落尚未明确。【方法】本研究采集我国华北地区潮土和亚热带红壤,利用平板计数、微量热技术和高通量测序技术研究了X射线扫描对可培养微生物数量、土壤微生物的代谢热和群落结构的影响。【结果】X射线辐射显著降低了2种土壤中活体细菌的数量,同时微生物的代谢活性也发生改变;在分子水平上,基于细菌16S r RNA基因的高通量数据显示2种土壤的细菌多样性指数发生了变化,而其群落结构均无改变。【结论】X射线断层扫描技术并不兼容土壤微生物功能的研究;但可兼容基于分子生物学的微生物群落结构分析。
  • 无乳链球菌鱼源株10kb基因序列对细菌致病力的影响
  • 【目的】在前期比较基因组学分析中,我们发现中国无乳链球菌鱼源株GD201008-001基因组中有一段10 kb基因序列,内含11个未知功能的开放阅读框。为了研究该段基因序列与细菌的致病力的关系,本研究将这段基因进行了全段缺失。【方法】运用链球菌-大肠杆菌穿梭质粒p SET4s,构建了10 kb基因缺失株(Δ10 kb),并通过生物学性状的比较,细胞粘附试验,斑马鱼攻毒试验和缺失前后毒力相关基因转录水平的检测,评价该序列对无乳链球菌毒力的影响。【结果】经测序证明缺失株Δ10 kb构建成功,与亲本株GD201008-001相比较,缺失株Δ10 kb在细菌染色形态、对HEp-2细胞的粘附能力无明显差异,但在培养液中的生长速度略慢;缺失株Δ10 kb对斑马鱼的毒力明显增强,LD_(50)有极其显著的差异(P〈0.001);编码菌毛骨架蛋白2b的基因(PI-2b)和唾液酸酶基因(neul)在缺失株中的转录水平明显上升。【结论】该序列对无乳链球菌GD201008-001的毒力有显著的影响,可能调控某些毒力基因的转录表达,使细菌的毒力减弱。
  • 共表达PCV2 ORF2和猪IL-18基因的重组猪伪狂犬病毒对小鼠的免疫原性
  • 【目的】研制猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的二联活疫苗,并用猪IL-18作为免疫佐剂。【方法】将猪IL-18基因插入到质粒p GO中,获得的重组转移质粒p GO18与猪PRV弱毒HB98株DNA共转染ST细胞,并进行空斑筛选和纯化;RT-PCR和Western blot分别从转录和蛋白水平鉴定其表达情况。将重组病毒PGO18和PGO、PRV弱毒株HB98、PCV2灭活商品苗和1640细胞培养基分别免疫6周龄雌性昆明小鼠,4周后二次免疫,二免后4周用PCV2 DF强毒和PRV Min/A强毒接种小鼠。通过ELISA、血清中和试验和流式细胞术及攻毒保护试验评价重组病毒的免疫原性。【结果】获得了重组病毒PGO18,并且可在ST细胞内表达;PGO18可诱导小鼠机体产生PCV2的ELISA和PRV的中和抗体水平,刺激CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群的增殖,且能有效抵抗PCV2和PRV强毒攻击。【结论】IL-18基因可增强重组病毒的免疫效果,使重组病毒具有良好的免疫原性,有望成为防治PCV2和PRV的候选疫苗株。
  • 高通量测序分析DNA提取引起的对虾肠道菌群结构偏差
  • 【目的】通过高通量测序技术,评价不同DNA试剂盒提取引起的对虾肠道菌群结构偏差,了解健康凡纳滨对虾肠道菌群结构特征。【方法】分别以细菌、粪便和组织DNA试剂盒3次重复提取凡纳滨对虾肠道总DNA(分别编号为SIB,SIS和SIT),检测DNA含量、纯度及其16S r DNA V4区可扩增性,进一步采用Illumina Mi Seq高通量测序比较SIB和SIS样品菌群组成和多样性。【结果】细菌试剂盒提取的虾肠总DNA效果最好,粪便试剂盒次之,而组织试剂盒所提DNA含量低且难以被扩增。从SIB和SIS样品分别获得52151±5085和55296±5147条有效序列,同一(46800条)测序深度下,SIS样品OTU(operational taxonomic unit)数量和Shannon多样性指数均显著高于SIB的,而SIB样品间OTU重复性则优于SIS样品间的。从SIB和SIS样品鉴定的优势门一致,均包括变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、放线菌门(Actinobacteria)和蓝细菌门(Cyanobacteria),但不同分类水平上绝大多数优势菌群丰度在两种样品间差异明显。【结论】高通量测序分析表明对虾肠道菌群结构因DNA提取方法不同而呈现显著偏差;本研究健康凡纳滨对虾肠道核心菌群主要由发光杆菌属(Photobacterium),乳球菌属(Lactococcus),弧菌属(Vibrio),Aliivibrio和3个分类未定属构成。
  • H-NS蛋白对副溶血弧菌hcp1的转录调控
  • 【目的】研究调控子H-NS对副溶血弧菌T6SS1结构蛋白基因hcp1的转录调控机制。【方法】利用Western blot检测Hcp1蛋白在野生株(WT)和hns基因敲除株(Δhns)中表达水平的差异。提取WT和Δhns的总RNA,采用实时定量RT-PCR的方法验证H-NS对hcp1的转录调控关系。进而采用引物延伸实验研究hcp1的转录起始位点,并根据产物的丰度判断H-NS对hcp1的调控关系。PCR扩增hcp1的整个启动子区DNA序列,并纯化His-H-NS蛋白,通过凝胶阻滞实验(EMSA)验证His-H-NS对hcp1启动子区是否具有直接的结合作用。【结果】Western blot和实时定量RT-PCR结果显示H-NS能抑制hcp1的表达;引物延伸结果显示hcp1只有一个转录起始位点T(–62)(翻译起始位点为+1),且其转录活性是H-NS和σ54依赖性的;EMSA实验表明H-NS对hcp1的启动子区具有直接的结合作用。【结论】H-NS能直接结合到hcp1启动子区而抑制其转录表达。
  • 47株空肠弯曲菌湖北禽源株的多位点序列分型
  • 【目的】为了解湖北地区家禽空肠弯曲菌的流行状况及其分子特征,应用多位点序列分型方法对2013–2014年的47株禽源空肠弯曲菌湖北分离株进行分子分型研究。【方法】以空肠弯曲菌的7个管家基因aspA、glnA、gltA、glyA、pgm、tkt和uncA为目的基因,提取样本基因组后PCR扩增,测序和分析。将测序结果上传数据库进行比对,制作成多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)遗传进化树。【结果】分离株共有38个ST型,10个克隆群,其中最多的克隆群为ST-353CC和ST-464CC,发现2个新的等位基因编号和25个新的ST型。遗传进化树显示,不同家禽宿主中空肠弯曲菌序列型存在一定的差异,不同地区和来源的空肠弯曲菌呈现出遗传多样性。【结论】本研究对湖北分离的47株禽源空肠弯曲菌进行了MLST分析,其结果显示菌株多样性较为丰富,将为我国家禽空肠弯曲菌的流行病学调查提供科学的数据。
  • [小型综述]
    Ⅰ-E型CRISPR/Cas系统介导适应性免疫分子机制研究进展(孙东昌;裘娟萍)
    厌氧氨氧化体的组成、结构与功能(赵弋戈;郑平)
    Epstein-Barr病毒的免疫调控与逃逸机制(肖楠阳;陈骐;蔡少丽)
    丛枝菌根真菌脂类代谢对共生信号调控的响应和反馈(田磊[1,2];李元敬[1,2];田春杰)
    [研究报告]
    近20年中国部分地区鸡源H9N2亚型禽流感病毒HA基因遗传演化及其变异频率(孟芳;徐怀英;张伟;黄迪海;张再辉;刘霞;常维山;秦卓明)
    产L-天冬氨酸α-脱羧酶细菌的分离、鉴定及发酵条件优化(冯志彬;张娟;陈国忠;察亚萍;刘进杰;葛宜和;程仕伟;于波涛)
    关键基因的修饰对枯草芽孢杆菌尿苷合成的影响(杨绍梅;郭磊;班睿;谢希贤)
    长双歧杆菌N-乙酰氨基己糖1-位激酶的活性位点(关婉怡;白静;周天惠;赵宝华)
    小鼠体内SEG蛋白靶向运送shRNA抑制狂犬病毒复制(杨瑞梅;王化磊[2,3];郑学星[2,3];单虎;杨松涛[2,3];夏咸柱[2,3])
    南大西洋深海热液区可培养硫氧化微生物多样性及其硫氧化特性(徐鈜绣;姜丽晶;李少能;钟添华;赖其良;邵宗泽)
    X射线对我国两种典型土壤中微生物活性及群落结构的影响(俎千惠[1,2];房焕[1,2];周虎;张建伟[1,2];彭新华;林先贵;冯有智)
    无乳链球菌鱼源株10kb基因序列对细菌致病力的影响(刘广锦;朱洁莲;石紫薇;丁铭;王茹怡;姚火春;陆承平;徐跑)
    共表达PCV2 ORF2和猪IL-18基因的重组猪伪狂犬病毒对小鼠的免疫原性(郭晓庆;朱前磊;潘鑫龙;杨兴武;乔涵;王淑娟;陈红英)
    高通量测序分析DNA提取引起的对虾肠道菌群结构偏差(温崇庆;何瑶瑶;薛明;梁华芳;董俊德)
    H-NS蛋白对副溶血弧菌hcp1的转录调控(王洁;董新波;高丽晓;周冬生;殷喆;张义全[1,2])
    47株空肠弯曲菌湖北禽源株的多位点序列分型(董俊[1,2];韩梅;周康;罗青平;邵华斌;张腾飞)
    《微生物学报》封面

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