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文献检索:
  • Neurexin 1β及其剪切变异体真核表达载体构建
  • [目的]构建大鼠Neurexin 1β(Nrx 1β)及其剪切变异体Nrx 1β(ΔS4)真核表达载体,并鉴定其在真核细胞中的表达能力。[方法]以提取的大鼠海马总RNA为模板,采用RT-PCR技术获得Nrx 1β及Nrx 1β(ΔS4)目的基因,通过分子生物学方法将目的基因亚克隆至p DsRed2-C1载体。重组体转染HEK293T细胞,免疫印迹检测Nrx 1β及Nrx1β(ΔS4)的蛋白表达。[结果]Nrx 1β及Nrx 1β(ΔS4)目的基因扩增成功,重组体酶切鉴定能观察到目的基因片段(约1500 bp处),Nrx 1β及Nrx 1β(ΔS4)测序结果与Gen Bank中的序列一致。免疫印迹显示,p DsRed2-C1-Myc-Nrx 1β或p DsRed2-C1-Myc-Nrx 1β(ΔS4)在HEK293T细胞中能表达Nrx 1β或Nrx 1β(ΔS4)。[结论]成功构建大鼠Nrx1β及其剪切变异体Nrx 1β(ΔS4)的真核表达载体,重组体在HEK293T细胞中高效表达。
  • 小鼠白细胞介素IL-35基因慢病毒表达载体的构建及鉴定
  • [目的]构建小鼠白细胞介素IL-35基因慢病毒表达载体并鉴定。[方法]通过PCR法扩增出小鼠IL-35基因片段,将其与经XhoⅠ和XbaⅠ双酶切的慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1连接,构建慢病毒重组质粒pLVX-IL-35-IRES-ZsGreen1。用无内毒素试剂盒提取重组质粒后,将其与病毒包装所需的3个辅助质粒共转染到人肾胚(HEK)293T细胞中包装能表达IL-35的慢病毒颗粒。该病毒培养上清经浓缩后,梯度稀释法检测其滴度。用浓缩后的病毒感染HEK293T细胞,然后通过荧光显微镜观察荧光蛋白的表达并结合RT-PCR法检测IL-35基因在该细胞中的表达。[结果]IL-35慢病毒表达载体构建成功,包装的慢病毒滴度为1×10^9TU/m L,通过荧光显微镜和RTPCR检测发现IL-35在HEK293T细胞中表达。[结论]成功构建IL-35慢病毒表达载体且IL-35蛋白能在HEK293T细胞中过表达。
  • 嵌合HCV串联多表位的乙肝S基因真核载体构建及表达
  • [目的]构建丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)串联多中和抗原表位与乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)S抗原嵌合基因真核表达质粒,并在293T细胞中进行表达。[方法]将HCV基因中高度保守且具有广谱交叉中和活性的三个表位和一个HVR1模拟表位串连。串联表位嵌合于HBV S基因的氨基端胞外区,形成嵌合基因MEpS;将基因克隆至真核表达载体pCI-neo中,构建重组质粒pCI-MEpS。将质粒转染至293T细胞中,间接免疫荧光及Western Blot检测嵌合基因的表达情况。[结果]重组质粒经双酶切证实构建正确;pCI-MEpS转染的293T细胞胞浆内可见较强的绿色荧光,Western Blot显示pCI-MEpS在相对分子量约38 kDa处可见蛋白条带。[结论]构建了HBV S抗原嵌合HCV串联多中和抗原表位的重组质粒,成功在293T细胞中表达,为制备嵌合HCV串联多中和抗原表位的HBV S抗原VLPs,研究嵌合VLPs免疫动物后产生的中和抗体的保护作用奠定了实验基础。
  • 非受体型酪氨酸激酶JAK1基因真核表达质粒的构建与真核表达
  • [目的]构建非受体型酪氨酸激酶JAK1(nonreceptor tyrosine kinase-JAK1)基因真核表达质粒pcDNA4.0-HisJAK1,并转染293T细胞进行真核表达。[方法]从Hela细胞中提取总的RNA,通过RT-PCR获得JAK1基因全长c DNA序列,并将其克隆至真核表达载体pcDNA4.0-His中,构建重组质粒pcDNA4.0-His-JAK1。将真核重组表达质粒转染293T细胞,转染48 h后,在荧光显微镜下观察转染情况。免疫印迹法检测JAK1蛋白转染24 h、36 h与48 h在293T细胞中的表达。[结果]经双酶切与质粒PCR鉴定质粒克隆正确,测序鉴定序列中第2199位碱基A突变为G,为同义突变,不影响氨基酸序列。转染293T细胞48 h后,间接免疫荧光实验显示在293T细胞中检测到绿色荧光。免疫印迹检测可见大小约为133 kDa的目的蛋白。[结论]成功获得JAK1基因全长序列,并成功构建pcDNA4.0-HisJAK1真核重组表达质粒,并在真核细胞293T中获得有效表达,为进一步研究JAK1蛋白质相互作用奠定了基础。
  • 慢病毒介导稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株构建
  • [目的]通过慢病毒载体系统获得稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株。[方法]PCR扩增FRT-LacZ基因,亚克隆至慢病毒载体p LVX-PGK-Puro。经四质粒包装系统共转染293FT细胞包装重组慢病毒并检测病毒滴度,获得的慢病毒感染MDCK细胞,经嘌呤霉素筛选和β-半乳糖苷酶原位染色检测筛选鉴定转基因细胞株。[结果]测序证实,成功构建重组慢病毒质粒p LVX-FRT-LacZ-PGK-Puro。包装产生的慢病毒滴度为4.04×10^7TU/m L,重组慢病毒感染MDCK细胞后筛选获得稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株。[结论]构建了稳定表达FRTLacZ基因的MDCK细胞株。
  • 猪PR-39抗菌肽基因在毕赤酵母中的表达
  • [目的]在毕赤酵母中表达抗菌肽PR-39基因,获得有抗菌活性的PR-39。[方法]根据酵母和猪密码子偏好性,对其密码子进行优化改造。将经SOE-PCR获得的PR-39基因与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建重组载体pPIC9K-PR-39。经SacⅠ线性化电击转化毕赤酵母GS115,取阳性克隆进行髙拷贝转化子筛选和诱导表达。[结果]pPIC9K-PR-39重组质粒构建成功,pPIC9K-PR-39菌株发酵产物检测结果对DH5α大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有抑菌效果。[结论]获得了PR-39基因的重组酵母,并用毕赤酵母系统成功地分泌表达了具有明显抗菌活性的抗菌肽PR-39。
  • 栀子类胡萝卜素剪切双加氧酶基因GjCCD4的克隆与原核表达
  • [目的]类胡萝卜素剪切双加氧酶(Carotenoid cleavage oxygenase,CCD)是西红花总苷生物合成途径的关键酶,本研究拟从栀子果实中克隆CCD基因。[方法]在NCBI数据库中搜索CCD蛋白,获得种子序列后,构建系统进化树,按照亲缘关系分组。再利用CODEHOP法,针对每个组设计简并引物,在栀子果皮和果肉c DNA中扩增,获得保守区段。然后通过RACE获得基因全长。构建pet28a原核表达载体,转化BL21(DE3)菌株后在30℃培养4 h,转化菌株Aritic Expression(DE3)后在15℃培养过夜,诱导蛋白表达。[结果]克隆了一个GjCCD4基因,长1 863 bp,编码的蛋白质N端序列变动较大,C端保守性强,N-末端含有一个叶绿体定位的信号肽。系统发育分析表明,GjCCD4蛋白与拟南芥和西红花的同源蛋白聚在同一个簇。在BL21(DE3)和AE(DE3)菌株的沉淀中表达出大量包涵体形式的融合蛋白,在BL21(DE3)菌株的上清中表达出少量可溶蛋白。[结论]获得了一个类胡萝卜素剪切双加氧酶基因GjCCD4,通过原核表达获得了少量可溶蛋白。
  • 人酪氨酸蛋白激酶Lyn的真核表达、纯化及鉴定
  • [目的]构建含人酪氨酸蛋白激酶Lyn基因的载体并进行真核表达、纯化和研究其对细胞增殖的影响。[方法]提取人Hela细胞总RNA,用RT-PCR方法获得Lyn基因并克隆至pcDNA3.1(-)载体。经双酶切、PCR和测序方法鉴定后,将重组质粒瞬时转染HEK 293T细胞表达目的蛋白,应用组氨酸标签镍离子螯合磁珠纯化融合蛋白,通过Western Blot检测蛋白的表达及纯化,并用CCK-8法检测过表达Lyn后细胞增殖能力的变化。[结果]成功构建真核表达质粒pcDNA3.1(-)-Lyn并进行瞬时表达和蛋白纯化,CCK-8法检测过表达Lyn的HEK 293T细胞的增殖能力显著性下降(P〈0.01)。[结论]Lyn在HEK 293T细胞中成功瞬时表达及纯化,并可以使细胞的增殖能力受到明显抑制,为稳定表达和深入研究其生物学功能及作用机制奠定基础。
  • 基于cytb基因分析帕米尔盘羊和新疆地方家绵羊的系统发育
  • [目的]研究帕米尔盘羊对新疆地方家绵羊是否有遗传贡献。[方法]测定了盘羊、家绵羊75个体的细胞色素b基因全序列,分析其遗传多样性,计算不同群体间遗传距离,进而构建系统发生树。[结果]新疆地方绵羊中检测到43个多态位点,定义为23个单倍型,单倍型多样度(Hd)为0.889±0.00102,核苷酸多样度(Pi)为0.521%。新疆地方家绵羊群体可分为4个支系(A、B、C和D),其中支系D首次在新疆多浪羊群体中被检测到。[结论]系统发育分析表明,新疆绵羊有多个母系起源或经过多次驯化,摩弗伦羊是绵羊母系祖先之一。
  • 大鲵补体C1q及其补体信号通路相关基因的生物信息学分析
  • [目的]对大鲵补体C1q及其补体信号通路相关基因进行生物信息学分析。[方法]利用BLAST软件从大鲵肝脏转录组中筛选获得其补体C1qcDNA全长,并进行了序列比对、系统进化树及3-D结构分析。对大鲵补体信号通路相关基因进行搜索并构建信号传导通路。[结果]大鲵补体C1qcDNA全长为990bp,编码246个氨基酸。大鲵补体C1q与其他物种C1q的序列相似性为32.9%~73.4%。一系列补体系统相关基因在大鲵中被发现,包括补体C1r、C1s、C2、C3、CA、C7、C8、C9以及补体调节蛋白等。[结论]获得了大鲵补体C1qcDNA序列及其信号传导通路基因(C1rxC1s、C2、C3、C4、C7、C8、C9)及调节蛋白,为深入研究两栖类乃至低等脊椎动物的补体系统功能奠定了基础。
  • 人转录因子AP4的生物信息学分析
  • [目的]预测分析人转录因子激活增强子结合蛋白4(activating enhancer binding protein 4,AP4)的性质、结构和功能。[方法]采用生物信息学方法对人AP4蛋白的理化性质、物种间同源性、信号肽与跨膜区、亲水性、蛋白亚细胞定位、蛋白质二/三级结构、三级结构可靠性、蛋白质相互作用等方面进行预测和分析。[结果]人AP4蛋白全长338个氨基酸,理论等电点5.63,相对分子质量38.73 kDa。AP4在进化上较为保守,不含信号肽与跨膜区,属于亲水性蛋白质,94.1%可信度定位于细胞核。二级结构含10个α螺旋区,占全部氨基酸的54.14%,5个β折叠区,占7.99%,其余37.87%的氨基酸处于无规卷曲状态。三维建模结果可靠。预测到10个与AP4存在相互作用的蛋白。[结论]系统预测分析了人AP4蛋白的性质、结构和功能。
  • 家蝇抗真菌肽衍生物MAF-1C抗白色念珠菌活性研究
  • [目的]探究家蝇抗真菌肽衍生物MAF-1C结构特点及抗白色念珠菌活性。[方法]采用氨基酸替代法设计MAF-1A衍生肽MAF-1C,生物信息学分析其理化特性,微量液体稀释法、菌落计数法检测体外抗白色念珠菌活性,扫描电镜观察对菌细胞结构的影响。[结果]MAF-1C为非跨膜阳离子线状多肽,带8个正电荷,二级结构以α螺旋为主。对白色念珠菌具有抗菌活性,MIC、MFC值分别为0.2 mg/m L和0.5 mg/m L,2×MIC浓度的MAF-1C从作用一开始就发挥抗菌作用,其作用后白色念珠菌细胞表面出现明显的凹陷、裂痕,之后细胞皱缩、裂解死亡,并且菌细胞损伤程度与肽浓度及作用时间呈正相关。[结论]MAF-1C结构参数及对白色念珠菌的抗菌活性均显著优于模板肽,对比模板肽改造后的肽阳离子电荷增加了6个,总平均疏水值(GRAVY)由-1.081升高到0.588,不稳定系数由42.27降低到5.83,MIC由0.6 mg/m L降低到0.2 mg/m L,MFC由0.7 mg/m L降低到0.5 mg/m L,其可通过破坏白色念珠菌细胞结构发挥抗菌作用。
  • 野生大鲵肠道细菌多样性及产酶活性研究
  • [目的]纯培养分离大鲵肠道细菌并研究其多样性及产酶活性。[方法]分离大鲵肠道细菌并进行胞外淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶活性研究,并应用16S rRNA系统发育分析对菌落进行分子鉴定。[结果]纯培养分离得到65株细菌,产酶活性结果表明:62株产蛋白酶、46株产淀粉酶、61株产纤维素酶、2株产脂肪酶。将65株细菌16S rRNA序列扩增并进行RFLP分析后选取33株进行测序,可划分为2个门5个属:变形菌门(Proteobacteria)占总数的54.5%,分为普罗维登斯菌属(Providencia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter);厚壁菌门(Firmicutes)占总数的45.5%,分为漫游球菌属(Vagococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)。[结论]大鲵肠道细菌产酶活性,分离出的细菌多样性丰富进行测序的肠道细菌可分为2门5属。
  • 三穗鸭ODC1基因多态性与屠体性状关联性分析
  • [目的]寻找与三穗鸭屠体性状相关的遗传标记。[方法]以139只贵州三穗鸭为研究对象,采用PCR-SSCP技术和DNA测序方法,对鸟氨酸脱羧酶1(Ornithine decarboxylase,ODC1)基因进行遗传多态性研究。[结果]在ODC1基因中检测到1个碱基变异,位于第4外显子109 bp处,为A→G突变,且在此位点的优势等位基因型为AA基因型,A为优势等位基因。ODC1基因Ex4处多态性对三穗鸭的腿肌重、半净膛重等屠体性状存在显著影响(P〈0.05)。[结论]研究初步推测ODC1基因多态性与屠体性状具有显著的影响,A109G可作为穗鸭屠体性状的遗传标记,为建立三穗鸭的分子辅助标记选择方法提供初步依据,推进选育进程。
  • 重组大肠杆菌多基因串联表达合成反式-4-羟基-L-脯氨酸
  • [目的]得到表达多个基因的重组大肠杆菌,以期实现葡萄糖为碳源生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。[方法]以菌液为模板,PCR得到不同来源的proB、proA、proC、p4h基因,重叠PCR串联相邻基因,所得片段通过无缝组装与p ET-28a载体连接,并在大肠杆菌BL21中表达,筛选阳性表达菌株,电泳及测序验证,重组菌在30 ml MCG培养基摇瓶中发酵,分光光度法和HPLC检测产量。[结果]0.5 mmol/L IPTG诱导24 h,5组串联基因成功在大肠杆菌中表达,并以葡萄糖为碳源,获得产物反式-4-羟基-L-脯氨酸,培养基不添加L-脯氨酸时E.coli BL21/p ET-28a-BAHHbs、E.coli BL21/p ET-28a-HBACkp和E.coli BL21/p ET-28a-HBAmg产量达到0.28 g/L、0.16 g/L和0.29 g/L,添加4 mmol/L的L-脯氨酸时,分别为0.64 g/L、0.55 g/L和0.74 g/L。[结论]proB、proA、proC及p4h基因成功在大肠杆菌中表达,5株重组菌在30℃摇瓶中诱导表达24 h得到产物反式-4-羟基-L-脯氨酸,其中E.coli BL21/p ET-28a-HBAmg产量达到0.74 g/L,为今后在发酵罐中生产奠定基础。
  • 抗CD133纳米抗体的分离与鉴定
  • [目的]获得骆驼来源的与人CD133抗原特异性结合的纳米抗体。[方法]从3峰新疆双峰驼外周血中分离淋巴细胞,采用巢式PCR扩增获得cDNA并构建VHH天然噬菌体展示文库。包被CD133-606于ELISA板,对天然文库进行3轮亲和筛选,菌落PCR和基因测序确定能结合CD133的候选克隆。挑选重复序列VHH克隆构建到pET28a并转BL21用IPTG诱导表达。IMAC方法纯化重组VHH抗体蛋白,Western Blot和ELISA检测与CD133的抗原结合性。[结果]从109淋巴细胞中构建了库容为1.4×10^9cfu的噬菌体展示文库,Western Blot及ELISA结果显示重复4次核苷酸序列的VHH-13的纳米抗体能与CD133-606有较好的结合活性。[结论]通过对VHH天然展示文库的亲和筛选及鉴定,成功获得了能与人重组CD133胞外区特异结合的纳米抗体。
  • 耦合培养法对10-DAB产量的影响
  • [目的]比较红豆杉内生真菌单独发酵和耦合发酵对10-DAB产量的影响,以获得10-DAB产量较高的发酵方法。[方法]比较了红豆杉枝条、产10-DAB菌株Trichoderma sp.单独发酵、红豆杉愈伤组织、红豆杉枝条和产10-DAB菌株Trichoderma sp.耦合发酵、红豆杉愈伤组织和产10-DAB菌株Trichoderma sp.耦合发酵5种方法 10-DAB的产量,用HPLC-MS方法验证产有10-DAB并检测其浓度。[结果]5种方法获得10-DAB浓度分别为274.6μg/m L、154.3μg/m L、189.4μg/m L、887.5μg/m L、684.7μg/m L,其中红豆杉枝条和产10-DAB菌株Trichoderma sp.耦合发酵浓度最高达887.5μg/m L,为耦合发酵法生产10-DAB奠定基础。[结论]利用红豆杉枝条与产10-DAB菌株耦合发酵生产10-DAB的产量要比菌株单独发酵的产量高出2.2倍。
  • T-2毒素诱导人结肠癌细胞凋亡的实验研究
  • [目的]研究T-2毒素对人结肠癌细胞SW115的增殖抑制与凋亡作用。[方法]体外培养人结肠癌细胞SW115,加入浓度为1.6、8、40、200、1 000μg/m L的T-2毒素作用24 h,MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡,Hoechest 33258染色法观察细胞凋亡形态,并检测Caspase-3的活性变化。[结果]与对照组相比,T-2毒素为40μg/m L时显著抑制SW115细胞增殖(P〈0.01),当T-2毒素达到200μg/m L,流式细胞仪检测凋亡率为27.55%,细胞内Caspase-3活性为0.597,差异具有统计学意义(P〈0.01)。[结论]T-2毒素对人结肠癌细胞SW115具有明显的抑制作用,具有诱导SW115细胞凋亡的作用。
  • [论著]
    Neurexin 1β及其剪切变异体真核表达载体构建(徐岩;侯筱宇)
    小鼠白细胞介素IL-35基因慢病毒表达载体的构建及鉴定(潘秀和;孙俊;刘超波;高巧艳;李燕;李明才)
    嵌合HCV串联多表位的乙肝S基因真核载体构建及表达(王晓岩;雷迎峰;李翠;林芳;崔颖;舒放;张惠中;韦三华)
    非受体型酪氨酸激酶JAK1基因真核表达质粒的构建与真核表达(庄斯慧;郭欣欣;梁君瑜;吴英松;刘天才)
    慢病毒介导稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株构建(谢宝明;于国伟;令世鑫[1,3];马忠仁[1,3];柏家林[1,3])
    猪PR-39抗菌肽基因在毕赤酵母中的表达(江学斌;陈嘉蔚;杨军;柯德森;肖安吉;卢志鹏;楚品品;黄朝远;蔡海明;马苗鹏;张玲华)
    栀子类胡萝卜素剪切双加氧酶基因GjCCD4的克隆与原核表达(王晓云[1,2];陈蓉[1,3];张恩慧)
    人酪氨酸蛋白激酶Lyn的真核表达、纯化及鉴定(张佳凤;郝文波;熊玉锋;徐岚;庄斯慧;罗树红)
    [技术与方法]
    基于cytb基因分析帕米尔盘羊和新疆地方家绵羊的系统发育(王世锋;蔡佳麒;沙晓娟;王玉涛;詹建立;张秀英)
    大鲵补体C1q及其补体信号通路相关基因的生物信息学分析(张启焕;齐志涛[1,2];乔帼;王资生[1,2];吕富;王普泽;邵荣[1,2])
    人转录因子AP4的生物信息学分析(赵文铖;王兆松;周蒙;魏梅;许世磊)
    家蝇抗真菌肽衍生物MAF-1C抗白色念珠菌活性研究(陈明明;王涛[1,2];林小金;胡红元;罗振华[1,2];吴建伟[1,2])
    野生大鲵肠道细菌多样性及产酶活性研究(刘栋;兰阿峰[1,2,3];王菲;郭素芬;邓百万[1,2];金文刚[1,3])
    [开发与应用]
    三穗鸭ODC1基因多态性与屠体性状关联性分析(李潇蒙[1,2];戴焰[1,2];周琳[1,2];林威[1,2];柳诚刚[1,2];陆曼[1,2];杨胜林[1,2])
    重组大肠杆菌多基因串联表达合成反式-4-羟基-L-脯氨酸(盛花开;衣玉兰;李志敏;叶勤)
    抗CD133纳米抗体的分离与鉴定(李玲霞;翟田甜;马晓玲;冯亚宁;李江伟)
    耦合培养法对10-DAB产量的影响(李勇超[1,2];杨靖;周修任;赵文恩)
    T-2毒素诱导人结肠癌细胞凋亡的实验研究(刘磊;冯淳;朱文赫;董媛;王会岩)
    《生物技术》封面

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