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肾缺血再灌注损伤中CD11a及髓过氧化酶的变化


□ 洪伟 王禾 石炳毅 沈瑞雄 柏宏伟

摘 要:

AIM:To investigate the change of CD11a and myeloperoxidase(MPO) content during rat renal ischemia-reperfusion injury(IRI),as well as the role of LFA-1 in renal IRI.METHODS:We utillzed the rat model of renal IRI to detect the renal tissue contents of CD11a and MPO.RESULT:Level of CD11a and MPO was very low in normal renal tissue,but was increased significantiy in those of ischemia reperfusion.And this level in the ischemia 60 min reperfusion group was higher than that in ischemia 30 min reperfusion group.CONCLUSION:Level of CD11a and MPO in rat renal tissue increased dignificantly during rat renal IRI.LFAK-1 mediated leukocyte adherence plays an important role in renal IRI.


【关键词】  淋巴细胞

    (第四军医大学西京医院泌尿外科, 陕西 西安 710033,解放军309医院泌尿外科, 北京 100091)

  【关键词】 淋巴细胞,功能相关,抗原 1;cd11a;髓,过氧化酶;肾,缺血再灌注,损伤

  【abstract】 aim: to investigate the change of cd11a and myeloperoxidase (mpo) content during rat renal ischemia-reperfusion injury (iri), as well as the role of lfa 1 in renal iri. methods:we utilized the rat model of renal iri to detect the renal tissue contents of cd11a and mpo. results: level of cd11a and mpo was very low in normal renal tissue, but was increased significantly in those of ischemia reperfusion. and this level in the ischemia 60 min reperfusion group was higher than that in ischemia 30 min reperfusion group. conclusion: level of cd11a and mpo in rat renal tissue increased significantly during rat renal iri. lfak 1 mediated leukocyte adherence plays an important role in renal iri.

  0          引言         

  肾脏缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,iri)与急性肾功能衰竭和移植肾功能恢复有密切关系,其机制并未十分清楚,近年研究认为粘附分子及其介导的中性粒细胞与内皮细胞的粘附在iri中起着重要的作用[1].我们利用大鼠肾脏缺血再灌注模型,观察肾缺血再灌注后cd11a的表达以及髓过氧化物酶(myeloperoxidase,mpo)活性的变化,探讨淋巴细胞功能相关抗原 1(lymphocyte function associated antigen 1, lfa 1)在肾脏iri的作用.

  1          材料和方法

  1.1          动物分组和模型制作          健康雄性sd大鼠45只,体质量(210±20) g(购自北京维通利华实验动物技术有限公司),随机分为假手术对照组、缺血30 min组和缺血60 min组,缺血组又再分为再灌注0,24,48和72 h组,每组5只.用速眠新(0.8 ml?kg-1体质量) im麻醉,正中剖腹,切除右肾,游离左肾蒂,以无损伤动脉夹夹闭左肾动脉30 min或60 min后松开动脉夹,若左肾灌注后由暗黑转为红润,表示灌注成功,关闭切口.假手术对照组仅游离左肾蒂,但不钳夹.分别于缺血终点(即再灌注0 h),再灌注后24,48,72 h后取左肾,迅速投入液氮中速冻备用.

  1.2          髓过氧化酶(mpo)测定          采用黎君友等改良的方法检测肾组织mpo活性[2],称取冰冻标本100 mg加1 ml磷酸钾缓冲液(20 mmol?l-1,ph 7.4),冰浴匀浆后离心(35 000 g,30 min,4℃).弃上清,加入1 ml 50 g?l-1溴化十六烷基三甲胺(htab),混匀后-70℃保存.取出融化后,超声破碎2 min,60℃水浴2 h后离心(35 000 g,10 min,4℃);取上清0.1 ml,加入2.9 ml反应液(含1.67 g?l-1邻联大茴香胺及0.005 ml?l-1 h2o2), 混匀后于460 nm处测30 s和90 s的a值.mpo活性(u?g-1)=δa×13.5.

  1.3          肾组织cd11a表达检测          采用免疫组化链霉亲和素-生物素(sabc)法染色并进行半定量分析,主要步骤为:① 冰冻切片用丙酮固定30 min,蒸馏水洗;② 用5 ml?l-1h2o2甲醇液阻断内源性氧化酶30 min,蒸馏水洗3次;③ 滴加正常兔血清封闭液,室温20 min.甩去多余液体,不洗;④ 滴加1∶50稀释的小鼠抗大鼠cd11a单克隆抗体(购自晶美公司为英国serotec公司产品),4℃过夜.0.1 mmol?l-1 pbs洗2min×3次;⑤ 滴加生物素化兔抗大鼠igg,37℃ 20 min.0.1  mmol?l-1 pbs洗2 min×3次;⑥ 滴加试剂sabc,37℃ 20 min.0.1 mmol?l-1 pbs洗5 min×4次;⑦ dab显色(dab显色试剂盒购自武汉博士德公司):取1ml蒸馏水,加试剂盒中a,b,c试剂各一滴,混匀后加至切片.室温显色,镜下控制反应时间,一般在2~3 min之间.蒸馏水洗涤;⑧ 苏木素轻度复染.脱水,透明,封片.显微镜观察.阴性对照试验用pbs代替一抗,其余步骤相同.每个标本随机选取10个高倍视野(×20),使用北京天地电子科技公司td 2000真彩色病理显微图像分析系统进行图像分析,取阳性细胞占视野的百分比进行统计,先将所得的百分数进行变量变换,用反正弦函数变换法[3],具体公式为:x=sin-1(x)1/2.变换后取每个标本的平均值进行统计分析.
统计学处理:所有数据以x±s表示,采用第四军医大学开发的splm统计软件处理实验数据,并进行方差分析,差异显著性标准为p<0.05.

  2          结果

  2.1          肾组织mpo活性          正常肾组织和单纯缺血组中mpo活性极低,再灌注后各组mpo活性均显著高于对照组(p<0 01).缺血60 min再灌注后各组与同一时间点缺血30 min组比较mpo均显著升高(p<0 01,表1),肾组织mpo活性于缺血再灌注24 h 达高峰,并随再灌注时间的延长而逐渐下降.

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