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Survivin在儿童急性淋巴细胞白血病的表达及中期随访报告


□ 方拥军 张兰芳 陆勤 杨引 芮耀耀

南京医科大学附属南京儿童医院血液肿瘤科,江苏南京210008

摘 要:

目的:了解Survivin在儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)的表达及预后意义。方法:测定了54例儿童ALL的标本,同时分析其临床特征、危险程度分类,并对所有病例进行2年的随访,并比较2年的无事生存率(EFS)。结果:ALL患者Survivin阳性41例,阴性13例,36例对照组Survivin皆为阴性。阳性组和阴性组在平均年龄、初诊时白细胞计数、肿瘤细胞百分数无统计学意义(P〉0.05),但阳性组中、高危病儿明显多于阴性组,Kaplan-Meier分析,Survivin阴性的2年EFS优于Survivin阳性组(P〈0.05)。结论:在儿童ALL Survivin的表达阳性病例中,中、高危病例数多,EFS时间短,预后差。

作者单位:(南京医科大学附属南京儿童医院血液肿瘤科, 江苏 南京 210008)

【摘要】  目的: 了解survivin 在儿童急性淋巴细胞白血病(all)的表达及预后意义。方法: 测定了54例儿童all的标本, 同时分析其临床特征、 危险程度分类, 并对所有病例进行2年的随访, 并比较2年的无事生存率(efs)。结果: all患者survivin阳性41例, 阴性13例, 36例对照组survivin皆为阴性。阳性组和阴性组在平均年龄、 初诊时白细胞计数、 肿瘤细胞百分数无统计学意义(p>0.05), 但阳性组中、 高危病儿明显多于阴性组, kaplanmeier分析, survivin阴性的2年efs优于survivin阳性组(p<0.05)。结论: 在儿童all survivin的表达阳性病例中, 中、 高危病例数多, efs时间短, 预后差。

【关键词】  survivin; 中期随访; 儿童; 急性淋巴细胞白血病

    与发达国家相似, 我国恶性肿瘤在整个病死原因中上升到主要地位, 成为威胁小儿生命的主要疾病, 而其中小儿急性淋巴细胞白血病(acute  lymphoblastic  leukemia, all)占首位。近20年来, 通过诊断手段的改进, 联合化疗及并发症、 支持治疗的进步, 小儿all已成为可治愈的恶性肿瘤[1]。对标危小儿all应用较微的化疗方案以减少治疗费用及各种合并症已经成为目前的趋势[2]。已知结合各种指标可以判断all的危险程度, 但仍然存在着一些不足, 寻求新的判断危险程度的指标仍然是目前研究的热点。survivin基因及其所表达的蛋白是近年来发现的一种新的凋亡抑制蛋白(iap)家族, 在正常的组织细胞中无表达而广泛表达于胚胎组织及大多数肿瘤细胞, 在实体瘤及儿童髓系白血病的研究表明: survivin的高表达表示肿瘤存在较差的预后[3-5]。在儿童all本病报道不多, 我们通过对儿童急性淋巴细胞白血病survivin的表达与生存分析来评判其在小儿all中的预后价值。

    1  材料和方法

    1.1  材料  2004-10/2006-12我院初诊all 54(男35, 女19)例, 年龄2~12岁, 并用同期非恶性肿瘤的血液病36例进行实验对照, 其中再生障碍贫血12例, 血小板减少性紫癜24例。两组病例在年龄、 性别上无显著差别。

    1.2  方法

    1.2.1  实验步骤  所有病例在治疗前抽取骨髓2~3 ml或外周静脉血5~6 ml, 用na2edta抗凝, 室温保存, 用淋巴细胞分离液分离单个核细胞, 离心2 000 r/min, 用trizol一步法提取mrna, 以-70℃冰箱冻存。 rtpcr: 以随机引物oligo(dt)15, 将上述标本逆转录合成cdna, 步骤为95℃、 5 min, 37℃、 60 min,  95℃、 5 min, 4℃保存。再用survivin和βactin(为内参照)的引物对上述冻存产物进行扩增, 步骤如下: 95℃、 1 min变性, 56℃、 0.5 min杂交, 72℃、 1 min延伸, 共30个循环, 最后4℃保存。oligo(dt)15、 amv、 dntp、 taq dna聚合酶、 rnase购自promega公司。产物与marker同时用15 g/l的琼脂糖凝胶电泳(120 v, 1 h), 溴化乙啶染色, 紫外灯观察、 分析结果并摄片。

    1.2.2  引物序列  survivin 的引物序列如下: forward 5′cgg ctc ctc tac tgt tta a3′, rewerse 5′caa atc cat cat ctt acg c 3′, 其产物为 463 bp; βactin的引物序列如下: forward:  5′ccaaccgtgaaaagatg3′, rewerse: 5′ccaatagtgatgaccgtg3′, 其产物为342 bp。

    1.2.3  终点事件观察  观察所有病例临床特征(包括年龄、 肿瘤细胞百分数、 初诊时危险程度分类)。对所有病例随访24个月以上, 终点事件为复发、 非白血病死亡。如果在随访时存活或失访, 非白血病死亡为截尾值, 比较两组患者的rfs、 efs、 os值。

    1.2.4  统计学分析  采用spss11.0统计学软件, 率的比较进行χ2检验, 由于t值小于5, 故使用精确概率法进行计算, 并进行kaplameier分析。

    2  结果

    2.1  rtpcr  结果如图1,  βactin为342 bp条带,  survivin阳性为463 bp条带, 其中1、 2、 6仅仅出现342 bp条带为survivin表达阴性, 4、 5出现463 bp和342 bp两条条带, 为survivin表达阳性。

    图1  rtpcr 结果

    1,  2:  survivin阴性病例; 3:  dna marker;  4,  5:  survivin阳性(463 bp); 6:  内参照(βactin为342 bp).2.2  survivin与βactin的表达  所有病例βactin皆为阳性, 说明了实验方法的可靠性, all患者survivin阳性41例, 阴性13例, 36例对照组survivin皆为阴性。

    2.3  survivin与all患儿临床特征的关系  survivin阳性与阴性病例在平均年龄、 初诊时白细胞计数及肿瘤细胞百分数无统计学意义(p>0.05, 表1)。表1  survivin 与all患儿临床特征的关系survivin平均年龄

    2.4  survivin 与all患儿危险程度分类比较  survivin阳性病例组中、 高危22例, 标危19例; survivin阴性病例组中、 高危2例, 标危11例, fish精确概率法, p=0.017, survivin阳性病例组中、 高危病例数明显高于survivin阴性病例组, 具有统计学意义。

    2.5  survivin的表达与all患儿的2年efs的kaplanmeier分析  通过对24月的efs分析, survivin阴性组病例的efs明显要高于阳性组, 具有统计学意义(p<0.05)。

    图2  survivin的表达与all患儿的3年efs的kaplanmeier分析

    3  讨论

    survivin基因定位于17q25, 其表达及其合成的蛋白通过直接或间接抑制casepase的活性, 下调p53或chras癌蛋白来抑制肿瘤的凋亡, 此外在细胞动力和细胞的分化中, 起着较为重要的作用, 在恶性肿瘤疾病中的过度表达导致癌细胞越过凋亡检查, 并且通过有丝分裂加重了恶变的进展, 导致了肿瘤细胞不易受药物等因素的影响, 而不易凋亡, 使得恶性肿瘤预后差[6]。

    在本次回顾性的研究中, 我们用rtpcr的方法测定了54例儿童all病例的survivin的表达, 观察其是否可以作为预测复发的重要预后指标。在本次研究中我们共检出survivin阳性41例, survivin阴性13例, 对照组(非恶性肿瘤组)无1例阳性。一般认为: survivin在正常的组织细胞中无表达, 而广泛表达于胚胎组织及大多数肿瘤细胞, 本研究同样显示在儿童all用rtpcr的方法也可以检出survivin的表达, 而正常非肿瘤对照无1例阳性。

    在本研究中我们通过对阳性和阴性不同临床特征比较, 观察其在预后中的作用。在发病特征上, 本研究表明: survivin阳性和阴性患者在年龄、 初诊时白细胞计数、 初诊时肿瘤细胞百分数等并无统计学意义。

    众所周知, 儿童all的危险程度与预后关系密切。一般而言, 标危白血病的儿童预后好于中高危病儿, 本研究中我们同样发现: 在中高危病儿survivin的表达明显高于表危白血病的儿童, 有明显的统计学意义(p<0.05), 说明survivin的表达与预后有着较密切的相关性。在对本研究患者25个月的随访资料进行的生存分析中, 我们用kaplanmeier方法进行的efs分析, 结果显示: survivin阴性组的病例的efs值明显高于阳性病例(p<0.05)。

    在成人各种恶性肿瘤及儿童急性髓性白血病及其他恶性肿瘤中皆有survivin的表达与预后研究的报道, 而儿童all报道不多见[7]。本研究初步证明: 在儿童all中, survivin的表达阳性病例中, 中、 高危病例数多, efs时间短, 预后差。因此我们推断: survivin可以作为预测复发的重要预后指标。我们建议: 对于survivin阳性的病例, 结合其他高危因子应采用较为强烈的治疗方案。

【参考文献】 ......(未完,请点击下方“在线阅读”)

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