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STZ大鼠心肌胆固醇转出相关基因mRNA表达的变化


□ 史连义 薛芳 李海丽 刘琨 姜玲玲

摘 要:

目的研究糖尿病大鼠心肌胆固醇转出相关基因表达的变化。方法用STZ选择性破坏大鼠胰岛β细胞,建立实验性糖尿病大鼠模型,动态观察分析糖尿病不同病程中大鼠心肌胆固醇转出相关基因过氧化物酶体增殖物活化受体α(PPARα),肝X受体α(LXRα),ATP结合盒转动体A1(ABCA1)mRNA表达以及胆固醇含量的变化。结果糖尿病12~17w时大鼠心肌PPARα激活,LXRα、ABCA1 mRNA表达增加,但心肌胆固醇含量没有变化。结论STZ诱导的糖尿病大鼠心肌随着PPARα的激活,LXRα、ABCA1 mRNA表达增加,PPARα、LXRα共同参与了胆固醇代谢。

作者单位:中国石油中心医院暨河北医科大学石油临床医学院检验科,河北 廊坊 065000

【摘要】    目的 研究糖尿病大鼠心肌胆固醇转出相关基因表达的变化。方法 用stz选择性破坏大鼠胰岛β细胞,建立实验性糖尿病大鼠模型,动态观察分析糖尿病不同病程中大鼠心肌胆固醇转出相关基因过氧化物酶体增殖物活化受体α(pparα),肝x受体α(lxrα),atp结合盒转动体a1(abca1) mrna表达以及胆固醇含量的变化。结果 糖尿病12~17 w时大鼠心肌pparα激活,lxrα、abca1 mrna表达增加,但心肌胆固醇含量没有变化。结论 stz诱导的糖尿病大鼠心肌随着pparα的激活,lxrα、abca1 mrna表达增加,pparα、lxrα共同参与了胆固醇代谢。

【关键词】  过氧化酶体增殖物活化受体α 肝x受体α atp结合盒转运体a1 胆固醇 心肌 糖尿病

  changes in mrna expression of cardiac genes involved in cholesterol efflux in stzinduced diabetes in the rats

  shi lianyi,xue fang, li haili, et al.

  test department of china petroleum center hospital & hebei medical university petroleum clinical medical college, shijiazhuang 050000, hebei, china

  【abstract】  objective  to investigate changes in mrna expression of cardiac genes involved in cholesterol efflux in stzinduced diabetes in rats. methods  experimental diabetes model was induced by stz destroying insular βcell selectively in rats. cholesterol content of myocardial tissue was measured by autobiochemicalanalyst using enzymatic procedure and the mrna levels of pparα, lxrα and abca1 in myocardial tissue were detected by rtpcr during course of diabetes. results  pparα was activated and the levels of lxrα, abca1 mrna increased at the 12th and 17th week, but no changes in cholesterol content were found in myocardial tissue of diabetic rats. conclusions  mrna expression of lxrα and abca1 are increased along with the activation of pparα in myocardium of diabetic rats. pparα and lxrα   together participate in cholesterol metabolism.

  【key words】  peroxisome proliferator activating receptorα (pparα); liver x receptorα (lxrα); atp binding cassette transporter a1 (abca1); cholesterol; diabetes;myocardium

  1  材料与方法

  1.1  材料  主要试剂与仪器:链脲佐菌素(stz)为sigma公司产品;trizol为北京鼎国生物技术有限责任公司产品;琼脂糖为biowest公司产品;溴化乙啶为promega公司产品;rt试剂盒、pcr试剂盒均为fermentas公司产品,胆固醇,葡萄糖试剂盒均为leadman公司产品。hitachi 20pr52d型低温高速离心机,olympus au600型全自动生化分析仪均为日本产品。mj research ptc200型pcr热循环仪为美国产品。dyyⅲ6b型电泳仪,zf90型紫外透射仪,捷达凝胶成像分析系统,dy891型电动匀浆机均为国产。动物及饲料:成年雄性清洁级wistar大鼠,体重200~250 g,由河北医科大学实验动物中心提供,合格证编号:605119。普通大鼠饲料购自河北医科大学实验动物中心。

  1.2  方法

  1.2.1  实验动物分组  将大鼠适应性喂养1 w后,随机分为4组:正常对照组(con组12只,其中6 w,12 w,17 w各杀4只);糖尿病6 w组(6dm组8只,糖尿病模型成功后6 w处死);糖尿病12 w组(12dm组8只,糖尿病模型成功后12 w处死);糖尿病17 w组(17dm组8只,糖尿病模型成功后17 w处死)。

  1.2.2  糖尿病模型制备  大鼠禁食12 h后,糖尿病各组大鼠一次性腹腔注射2% stz(stz临用前用0.1 mol/l,ph4.5柠檬酸钠缓冲液配制)65 mg/kg,注射后72 h,尾静脉采血测定禁食6h后的空腹血糖,血糖浓度大于16.7 mmol/l的大鼠定为糖尿病大鼠。正常对照组大鼠腹腔注射等量柠檬酸钠缓冲液。各组分别于糖尿病大鼠模型建立后6 w末、12 w末、17 w末的前1 d禁食12 h,次日腹腔内注射10%水合氯醛(0.37 g/kg)进行麻醉后颈动脉插管取血,分离血清用于血糖测定;打开胸腔,迅速取出心脏,剪去血管和心脏周围结缔组织,立即置于液氮中,于-70℃保存,用于总mrna的提取和心肌胆固醇提取测定。血糖的测定:应用olympus au600 型全自动生化分析仪。

  1.2.3  心肌组织胆固醇的测定  参照文献〔3〕提取心肌组织总脂,准确称取一定量的心肌组织,按照50 mg组织加1 ml氯仿/甲醇(2∶1 v/v)的比例,加入一定量氯仿/甲醇匀浆,37℃保温30 min,3 000 r/min,离心5 min,收集底部的氯仿层液体到一新的ep管中,按照1 ml匀浆液加0.2 ml生理盐水的比例,加入生理盐水,3 000 r/min,离心5 min,再重复一次后收集氯仿层液体,用氮气吹干,加入120 μl异丙醇∶triton x100(9∶1 v/v)溶液复溶,漩涡震荡2 min,加蒸馏水180 μl,漩涡震荡2 min,充分溶解,此溶液为提取的心肌组织总脂。应用olympus au600型全自动生化分析仪及试剂盒测定胆固醇。心肌胆固醇含量以每克湿重心肌组织所含胆固醇毫摩尔数表示(mmol/g)。

  1.2.4  心肌组织各待测基因mrna 的测定  采用trizol一步法提取心肌组织总rna,琼脂糖凝胶电泳鉴定rna完整性,紫外分光光度法鉴定rna的量和纯度,以逆转录酶聚合酶链反应(rtpcr)法对mrna进行半定量分析。引物序列及产物长度如下:pparα引物5′cctggaaagtcccttatct3′,5′tcctgcgagtatgaccc3′产物640 bp。aco引物5′agggaatatggcatctcg3′,5′gtggttctggttcgcttt3′产物736 bp。lxrα:引物5′ctgaagcgtcaagaagagg3′,5′tagcatccgtgggaacat3′产物690 bp。abca1:引物5′gtgaacgagtttcggtatg3′,5′ttggacagccagtagatga3′产物527 bp。gapdh 引物5′gctgagtatgtcgtggagt3′,5′tcttctgagtggcagtgat3′产物286 bp。pcr采用分管扩增。扩增后取5 μl产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,用凝胶图像分析仪扫描分析pcr产物的积分光密度值,以gapdh为内参照,用目的基因与gapdh的积分光密度值之比表示mrna相对水平。

  1.3  统计学处理  所有数据均用x±s表示,采用spss13.0软件进行统计学处理分析,组间比较用方差齐或不齐的单因素方差分析检验。

  2  结  果

  2.1  血葡萄糖结果  正常对照组及糖尿病6、12、17周组血葡萄糖分别为:(5.52±2.22)mmol/l,(28.64±3.79)mmol/l,(26.75±2.53)mmol/l,(26.10±2.63)mmol/l。对照组血糖浓度均<16.7 mmol/l,糖尿病各组血糖浓度均>16.7 mmol/l,说明糖尿病各组制模成功无反复。

  2.2  各组心肌胆固醇含量  6dm组、12dm组和17dm组心肌胆固醇含〔n=8,(4.271 8±0.396 5)、(4.386 5±0.549 1)、(4.239 1±0.357 4)mol/l〕与con组〔n=12,(4.059 1±0.348 3)mol/l〕无明显差异(p>0.05),说明至糖尿病17 w心肌中无胆固醇沉积。

  2.3  糖尿病不同时期各组的心肌目的基因mrna表达变化  pparαmrna表达始终没有增加(p>0.05),但从糖尿病12 w开始,其靶基因aco mrna表达开始增加(p<0.01),说明pparα被激活。伴随着pparα被激活,lxrα mrna也从12 w始表达增加(p<0.01);abca1 mrna的表达在12 w出现增加的趋势,到17 w显著增加(p<0.01)。说明在糖尿病过程中虽然pparα mrna表达没有增加,但被激活。aco mrna,lxrα mrna水平伴随着pparα的激活而增加。见表1、图1。表1  不同时期各组心肌pparα,aco,lxrα和abca1 mrna的表达

  3  讨  论

  lxr是一类配体激活的核转录因子,分为lxra和lxrβ。lxr最有效的内源性激动剂是22(r)羟胆固醇(hydroxycholesterol,ohc)、24(s)羟胆固醇和24,25环氧胆固醇〔4〕。lxrα是机体胆固醇水平的传感器,调控胆固醇转运、代谢和清除过程中的多种酶的表达,维持组织细胞的胆固醇水平处于动态平衡之中。细胞内的胆固醇水平一方面取决于细胞的自身合成或通过ldl途径摄取,另一方面取决于细胞将胆固醇与脂肪酸结合成胆固醇酯储存或通过abca1apoaⅰ/hdl途径将细胞内的游离胆固醇转运至胞外,进入血液循环。abca1是一种膜蛋白,其主要功能是负责胞内胆固醇向胞外的跨膜转运,是胆固醇转运的限速蛋白,被称为细胞胆固醇转出的守门人〔5〕。abca1 mrna的转录,又受其上游基因lxrα调控。本研究中,大鼠自糖尿病12 w开始,心肌 lxrα及其下游基因abca1的mrna都表达增加,表明此时糖尿病心肌细胞胆固醇向胞外的跨膜转运加速。

  pparα是调节脂肪酸分解代谢的重要的核转录因子,被称为脂肪酸感受器,在心肌中表达丰富。脂肪酸尤其是长链脂肪酸是其内源性激动剂。糖尿病时由于胰岛素缺乏和(或) 胰岛素抵抗使组织葡萄糖利用障碍,因而,机体脂肪动员增加,脂肪酸增高,慢性激活pparα。激活的pparα与所调节的基因启动子上游pparα反应元件(ppre)结合而发挥转录调控作用〔6,7〕。本实验条件下,虽然pparα 的表达未增加,但其下游基因aco mrna表达增加,表明pparα 被激活。巨噬细胞实验显示,激活的pparα可通过激活脂肪酸β氧化途径中关键酶的表达,使细胞内脂肪酸的含量下降,从而降低胆固醇在细胞内的酯化,促进胆固醇向细胞外的转运〔8〕。本研究中,不同病程(至发病17 w)糖尿病大鼠的心肌细胞内,胆固醇总含量保持不变,应与abca1 mrna表达增加,进而胆固醇转出细胞增加有关。

  pparα激活剂可通过lxrα启动子上pparα反应元件(ppre)上调小鼠〔1〕和人〔9〕lxrα的表达。pparα的激活物能诱导人巨噬细胞lxrα的下游基因abca1的表达,促进非酯化的胆固醇从巨噬细胞移出〔2〕。因大鼠lxrα上游还未发现ppre,所以,lxrα的激活被认为是pparα激活剂使其下游基因细胞色素p450类羟化酶基因的转录,进而增加了lxrα内源性激活物25和27羟胆固醇所致〔10〕。本实验条件下,大鼠心肌pparα的激活也能使lxrα及其下游基因abca1 mrna表达上调。虽然其调控机制有待进一步研究,但此结果表明,大鼠心肌lxrα和pparα存在交互作用,共同调节胆固醇的转出。

  脂代谢紊乱是糖尿病并发症发生的一个重要原因。肾脏组织胆固醇及甘油三酯的沉积是糖尿病肾病的一个重要原因 〔11〕;血管胆固醇的沉积是动脉粥样硬化及冠心病的一个主要原因;糖尿病后期,心肌pparα mrna表达下降〔12〕,脂肪酸的沉积又是糖尿病心肌病的一个重要原因〔13〕。但在本实验条件下,不同病程心肌的pparα mrna表达都未发现下降,细胞内胆固醇的总含量也未发现增加,这可能是由于我们的研究时间较短的原因。

【参考文献】 ......(未完,请点击下方“在线阅读”)

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