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硫酸镁对兔视网膜缺血再灌注损伤的保护作用


□ 刘瑞芳 万新顺 韩丽英

摘 要:

目的探讨硫酸镁对实验性兔视网膜缺血再灌注损伤后的保护作用及其机制。方法用眼内灌注法制成视网膜缺血再灌注模型。32只健康成年新西兰大白兔随机分为对照组、模型组、硫酸镁治疗A组和硫酸镁治疗B组。硫酸镁治疗A组于缺血后立即按140mg·kg^-1耳缘静脉推注2mol·L^-1硫酸镁,随后腹腔内补充注射1g;硫酸镁治疗B组于缺血后,按600mg·kg^-1腹腔内注射2mol·L^-1硫酸镁。各组分别于再灌注6h后空气栓塞法处死兔,经光镜、电镜观察视网膜的改变。结果再灌注6h后,光镜下模型组视网膜神经节细胞层、内核层变薄,电镜下出现核固缩,线粒体空泡化。经硫酸镁治疗后视网膜神经节细胞层、内核层的形态学明显改善,且硫酸镁治疗A组视网膜神经节细胞层和内核层损害较硫酸镁治疗B组明显减轻。结论硫酸镁可能在治疗视网膜缺血性疾病中有一定应用价值。

作者单位:新乡医学院眼科教研组,河南 新乡 453003

【摘要】  目的 探讨硫酸镁对实验性兔视网膜缺血再灌注损伤后的保护作用及其机制。方法 用眼内灌注法制成视网膜缺血再灌注模型。32只健康成年新西兰大白兔随机分为对照组、模型组、硫酸镁治疗a组和硫酸镁治疗b组。硫酸镁治疗a组于缺血后立即按140 mg·kg-1耳缘静脉推注2 mol·l-1硫酸镁,随后腹腔内补充注射1 g;硫酸镁治疗b组于缺血后,按 600 mg·kg-1腹腔内注射2 mol·l-1硫酸镁。各组分别于再灌注6 h后空气栓塞法处死兔,经光镜、电镜观察视网膜的改变。结果 再灌注6 h后,光镜下模型组视网膜神经节细胞层、内核层变薄,电镜下出现核固缩,线粒体空泡化。经硫酸镁治疗后视网膜神经节细胞层、内核层的形态学明显改善,且硫酸镁治疗a组视网膜神经节细胞层和内核层损害较硫酸镁治疗b组明显减轻。结论 硫酸镁可能在治疗视网膜缺血性疾病中有一定应用价值。

【关键词】  硫酸镁 视网膜 缺血再灌注 兔


  protective effects of magnesium sulfate on retina of rabbit with ischemiareperfusion injure

  liu ruifang,wan xinshun,han liying

  department of opthalmology,xinxiang medical college,xinxiang 453003,china

    abstract:  objective  to investigate the protective effect of magnesium sulfate(mgso4) on retina of rabbit with ischemiareperfusion injury.methods  the model of experimental retinal ischemiareperfusion injury was created by intraocular perfusion.thirtytwo rabbits were randomly divided into model group,control group and mgso4 treatment group a and mgso4 treatment group b.mgso4 treatment group a was given 2 mol·l-1 mgso4 (140 mg·kg-1) through intravenous injection postischemia,then 1 g mgso4 was given to them by intraperitoneal injection.mgso4 treatment group b was given 2 mol·l-1 mgso4(600 mg·kg-1) through intraperitoneal injection postischemia.reperfusion for 6 hours,then killed the rabbits with air embolism and observed the changes of retina by light microscope and electron microscope.results  stratum ganglionare nervi optici and inner nuclear layer became thinner under light microscope,and there was pyknosis and mitochondria vacuolization under electron microscope after reperfusion for 6 hours.the morphology of stratum ganglionare nervi optici and inner nuclear layer improved obviously after treatment with mgso4,and the injure of mgso4 treatment group a was lower than mgso4 treatment group b.conclusion  magnesium sulfate may have some applied value for treating the disease of retina ischemia.

    key words:  magnesium sulfate;retina;ischemiareperfusion;rabbits
   
    视网膜缺血性疾病是临床中比较常见的致盲性眼病,目前无理想的药物治疗方法。研究证实,钙超载是缺血引起细胞死亡的一个必要条件[12],镁离子是钙离子的天然拮抗剂,硫酸镁目前已广泛应用于脑缺血神经保护的治疗。作者采用兔高眼压视网膜急性缺血模型,通过观察硫酸镁对视网膜的形态学影响,探讨硫酸镁对家兔视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemic reperfusion injury,riri)保护作用的可能机制。

  1  材料与方法

  1.1  实验动物 

  健康成年新西兰大白兔32只(郑州大学医学院实验动物中心提供)许可证号scxk20020027,体质量1.5~2.5 kg,雌雄不限。

  1.2  模型制作

  32只大白兔随机分为对照组、模型组、硫酸镁治疗a组,硫酸镁治疗b组,各组8只,实验前裂隙灯及眼底镜检查眼部无异常,眼压计测量排除高眼压兔。对照组自由生长,不予任何处理。模型组、硫酸镁治疗a组、硫酸镁治疗b组大兔采用眼内灌注法,用30 g·l-1戊巴比妥钠30 mg·kg-1的剂量耳缘静脉注射麻醉,10 g·l-1丁卡因点眼局部麻醉,复方托吡卡胺眼液点左眼散大瞳孔。将麻醉后的大兔固定在手术台上,开睑器开睑,将连接无菌生理盐水的头皮针从颞侧角膜缘刺入左眼前房固定,并维持在前房中央,斜面向视盘方向,升高输液瓶高度至左眼垂直距离164 cm处,此高度在眼内形成120 mmhg(1 mmhg=0.133 kpa)的眼内压。外观可见球结膜苍白,瞳孔红光反射消失,眼底镜(+8~+10 d)可见:眼底视网膜血管断流,视网膜苍白水肿。维持45 min后,降低输液瓶高度达右眼水平,拔出针头,轻压角膜缘,放出房水,眼球变软,可见球结膜充血,瞳孔出现红光反射,视网膜血液恢复,即为视网膜缺血再灌注损伤模型建立成功。模型建立后,硫酸镁治疗a组按140 mg·kg-1耳缘静脉推注2 mol·l-1硫酸镁(扬州中宝制药公司,批号 0201152),随后一次性腹腔内补充注射硫酸镁1 g。硫酸镁治疗b组按600 mg·kg-1腹腔内注射2 mol·l-1硫酸镁。模型组不予任何药物。实验中,维持动物体温36.5 ℃~37.0 ℃,并间断用抗生素眼液(妥布霉素眼液)点眼,维持角膜湿润和防止感染。

  1.3  电子显微镜标本的制备及观察 

  各组动物分别于再灌注6 h后摘取眼球,将所摘眼球在冰上沿矢状轴稍偏侧(外侧)切开眼球,去除晶状体、玻璃体,取颞侧(右眼9点,左眼3点)距视神经2 mm处1块2 mm×2 mm全层球壁块,立即置于体积分数2.5%戊二醛溶液中固定24 h后,磷酸缓冲液冲洗,体积分数1%锇酸固定,脱水包埋,切片,醋酸铀液染色,柠檬酸铅液染色,透射电子显微镜(日立产 h7650型)观察视网膜超微结构并拍照。

  1.4  光学显微镜标本的制备及观察 

  将所摘取各眼球于颞上象限取1块8 mm×8 mm全层球壁块,置入体积分数10%甲醛中,后酒精梯度脱水,透明,石蜡包埋,染色,后在光镜下观察其视网膜组织结构的改变并拍照。

  2  结果

  2.1  硫酸镁对模型兔视网膜影响的光镜观察 

  对照组视网膜各层组织结构清晰,节细胞密集排列,细胞体积大,核圆形或椭圆形。缺血45 min再灌注6 h后,模型组兔视网膜神经节细胞层 、内核层可见到细胞核固缩或浓缩,视网膜神经节细胞层明显变薄,内核层变化不明显。经硫酸镁治疗后视网膜神经节细胞层较模型组增厚,并且硫酸镁治疗a组改变明显。视网膜神经节细胞层和内核层损害较硫酸镁治疗b组明显减轻。见图1~图4。

  2.2  硫酸镁对模型兔视网膜影响的电镜观察 

  对照组视神经节细胞核大而圆,核膜清晰完整,染色质分布均匀,细胞器排列整齐,视杆细胞、视锥细胞排列整齐,结构清晰。模型组视网膜神经节细胞层、内核层的细胞显示细胞核溶解,早期染色质边集,内质网疏松化,晚期细胞膜溶解,细胞器流失。视网膜神经节细胞层、内核层可见到散在的细胞浆,细胞核浓缩或皱缩及电子密度高的小体。视杆细胞、视锥细胞排列紊乱,结构不清晰。硫酸镁治疗后上述改变明显减轻,且硫酸镁治疗a组视网膜神经节细胞层损害较硫酸镁治疗b组轻。见图5~图10。

  3  讨论

    本实验利用升高兔眼内压致视网膜缺血模型,提高输液瓶高度到164 cm处,形成120 mmhg(1 mmhg=0.133 kpa)的眼压,以使视网膜血管断流而造成视网膜缺血,这种方法较动脉结扎法简便,是一种广泛采用的急性缺血性损伤的模型[1]。实验结果显示缺血45 min再灌注6 h后,兔视网膜神经节细胞层和内核层明显变薄,视杆细胞、视锥细胞排列紊乱,结构不清晰。与对照组比较,模型组视网膜神经节细胞层、内核层的细胞显示细胞核溶解。此造模方法一般来说主要损伤视网膜神经节细胞层和内核层。视网膜神经节细胞层主要由神经节细胞核组成,内核层主要由双极细胞、水平细胞及无长突细胞的细胞核组成。视网膜的血管是终末血管,彼此间无吻合支,当高眼压造成视网膜缺血时,由于能量障碍,机体兴奋性毒素大量释放,缺血早期靠近细胞核膜染色质边集、浓缩,同时核浆和细胞器进行性水肿变性,线粒体肿胀,空泡化,嵴消失,内质网疏松,随后细胞膜溶解,细胞器流失,这些变化也说明了该造模方法的特异性变化[2]。

    镁离子作为人体必不可少的微量元素之一,在体内有重要的生理功能,可激活atp酶系统,参与体内多种代谢过程,如糖酵解、氧化磷酸化及dna、rna蛋白质合成等[34]。成人血清镁0.8~1.05 mmol· l-1,仅次于钾、钠、钙含量,是人体内一种重要的阳离子。正常情况下,细胞内外的镁浓度没有跨膜梯度,细胞内以atpmg2+复合物的形式存在,镁离子在体内起重要的调节作用。由于硫酸镁静脉给药能顺利通过血脑屏障,在治疗脑血管病,如缺血缺氧性脑病有很大的应用价值[57]。

    本实验结果表明,视网膜缺血后给予硫酸镁治疗,能明显减轻视网膜神经细胞的损伤。在脑缺血神经保护方面,muir等[8]认为在最短的时间内使血清镁离子浓度水平达正常生理水平的2倍为宜。静脉给药可以尽快使药物浓度达到最佳的治疗要求。本实验采用2种不同的给药途径,其中在硫酸镁静脉给药治疗组可见细胞水肿变性坏死程度较轻,细胞减少程度不明显,显微结构观测结果显示视网膜神经节细胞层、内核层的细胞线粒体空泡化、内质网肿胀的程度亦较轻,提示静脉给药效果优于腹腔给药。

    硫酸镁对缺血再灌注损伤保护作用的可能机制如下:(1)增加视网膜缺血区的血流;(2)非特异性的电压依赖性钙通道阻滞剂;(3)谷氨酸nmdar的非竞争性拮抗剂,镁离子通过内皮细胞前列腺环素释放的刺激作用引起血管扩张,mg2+阻滞电位-依赖性n甲基d门冬氨酸(nmethyldaspartate,nmda)受体的离子通道起到非竞争性nmda拮抗剂的作用[910];(4)改善能量代谢,维持细胞内外离子梯度,降低去极化程度;(5)促进缺血后细胞能量代谢的恢复,提高线粒体钙离子的缓冲能力[11]。

    目前防治视网膜缺血再灌注损伤药物中,许多因副作用限制了其临床应用,寻找临床应用方便有效的药物成为目前研究的热点[8,1214]。硫酸镁可静脉给药,并且价格低廉,副作用小,在治疗脑缺血神经保护方面已经临床应用并取得较好疗效,而在眼科视网膜神经保护方面亦可能有其潜在的应用前景。

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