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锌和维生素E对糖尿病大鼠心肌结构变化的影响保护作用


□ 黎艳 张端莲

摘 要:

目的:探讨锌和维生素E对糖尿病大鼠心肌结构的影响.方法:按体重随机分为正常对照组(10只)和实验组(40只),各组大鼠禁食12h后,实验组大鼠以60mg/kg的剂量一次性腹腔注射STZ溶液(用0.1mol/L、pH=4.4的构橡酸盐缓冲液在冰浴下配镧成11mg/ml的STZ溶液),正常对照组大鼠(NC)注射等体积的枸橡酸盐缓冲液,观察动物饮水、进食及尿量变化等情况.1周后,采尾血测血糖,以血糖浓度〉16.6mmol/L,饮水量〉40ml/d,尿糖强阳性(+++~++++)的大鼠作为糖尿病大鼠.选取糖尿病大鼠40只按血糖值参考体重分为4组:糖尿病对照组,糖尿病补锌组,糖尿病补VE组,糖尿病补Zn和VE组.6周后将各组大鼠处死,切取心室肌组织。进行免疫组织化学的实验观察.结果:糖尿病对照组心肌细胞Bcl-2表达弱;糖尿病补锌组和糖尿病补VE组心肌细胞Bcl-2呈弱表达;糖尿病补Zn+VE组心肌细胞Bcl-2呈强阳性表达.图像分析结果显示,糖尿病补Zn+VE组与糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补Ⅶ组之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P〈0.05),糖尿病对照组与糖尿病补锌组、糖尿病补VE组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P〉0.05).结论:Zn和VE联合使用对糖尿病大鼠心肌细胞有保护作用.

作者单位:武汉大学医学院人体解剖与组织胚胎学系 武汉430070

【摘要】  目的:探讨锌和维生素e对糖尿病大鼠心肌结构的影响。方法:按体重随机分为正常对照组(10只)和实验组(40只),各组大鼠禁食12h 后,实验组大鼠以60mg/kg的剂量一次性腹腔注射stz溶液(用0.1mol/ l、ph = 4.4 的构橼酸盐缓冲液在冰浴下配制成11mg/ml的stz 溶液),正常对照组大鼠(nc)注射等体积的枸橼酸盐缓冲液,观察动物饮水、进食及尿量变化等情况。1周后,采尾血测血糖,以血糖浓度> 16.6mmol/l ,饮水量> 40ml/d ,尿糖强阳性( + + + ~ + + + + )的大鼠作为糖尿病大鼠。选取糖尿病大鼠40只按血糖值参考体重分为4组:糖尿病对照组,糖尿病补锌组,糖尿病补ve组,糖尿病补zn和ve组。6周后将各组大鼠处死,切取心室肌组织,进行免疫组织化学的实验观察。结果:糖尿病对照组心肌细胞bcl2表达弱;糖尿病补锌组和糖尿病补ve组心肌细胞bcl2呈弱表达;糖尿病补zn+ve组心肌细胞bcl2呈强阳性表达。图像分析结果显示,糖尿病补zn+ve组与糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补ve组之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(p<0.05);糖尿病对照组与糖尿病补锌组、糖尿病补ve组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(p>0 05)。 结论: zn和ve联合使用对糖尿病大鼠心肌细胞有保护作用。

【关键词】  锌; 维生素e; 糖尿病; 心肌; 图像分析

  糖尿病性心肌病是糖尿病的慢性并发症之一,是糖尿病发病过程中特异性的心肌受损和心脏功能改变,糖尿病性心肌病的出现可以不伴有缺血性病变、血管病变及高血压等并发症。目前糖尿病性心肌病的确切病因还不清楚,但目前认为糖尿病性心肌病的发生主要与心肌能量代谢紊乱、ca2+超载、血管动脉硬化、氧化应激、高血压及高血糖导致的心肌细胞凋亡等有关。本研究应用光镜观察了锌和维生素e联合应用对高血糖引起的心肌细胞的保护作用,旨在探讨两者对糖尿病大鼠氧化应激时心肌结构的影响。

  1  材料与方法

  11  材料昆明种sd大鼠50只,雄性,体重180~200g,由武汉大学医学院实验动物中心提供,适应饲养1周后进行实验。

  12  方法

  121  动物模型建立及分组  按体重随机分为正常对照组(10只)和实验组(40只) ,各组大鼠禁食12h 后,实验组大鼠以60mg/kg的剂量一次性腹腔注射stz溶液(用0.1mol/ l、ph = 4.4 的构橼酸盐缓冲液在冰浴下配制成11mg/ml的stz 溶液),正常对照组大鼠(nc)注射等体积的枸橼酸盐缓冲液。观察动物饮水、进食及尿量变化等情况。1周后,采尾血测血糖,以血糖浓度> 16.6mmol/ l ,饮水量> 40 ml/ d ,尿糖强阳性( + + + ~ + + + + )的大鼠作为糖尿病大鼠。选取糖尿病大鼠40只按血糖值参考体重分为4组:糖尿病对照组,糖尿病补锌组,糖尿病补ve组,糖尿病补zn+ve组。各组动物均喂饲人工合成饲料,配方:酪蛋白20 % ,玉米淀粉65% ,植物油8% ,纤维素1% ,混合维生素1% ,混合无机盐5%。混合维生素和无机盐配方参见文献[5],合成饲料控制锌浓度为20mg/kg。正常对照组和实验组给予去离子水;补zn 组给予zn 浓度为20 mg/l的含znso4·7h2o 去离子水;补ve 组每天以50mg/ kgve 灌胃;zn和ve联合补充组在给予zn浓度为20mg/l的含znso4 ·7h2o 去离子水的同时以50mg/kgve灌胃。实验期间,密切观察动物进食和饮水量变化,每周称两次体重,6周后将各组大鼠处死,切取心室肌组织,进行免疫组织化学实验观察。

  122  免疫组织化学sp法检测bcl2相关抗原主要步骤:①组织切片5 μm,常规脱蜡至水,蒸馏水洗;②3%过氧化氢,37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性,pbs洗4×5min;③bcl2采用微波抗原修复(3档,10 min), pbs洗4×5min;④正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应;⑤一抗(bcl2,1: 100)37℃孵育1 h,pbs洗4×5min;⑥生物素标记的二抗,37℃孵育10 min,pbs洗4×5min;⑦链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物37℃孵育10 min,pbs洗4×5min;⑧dab显色液显色,自来水冲洗终止反应;⑨苏木精复染,脱水,透明,封片。用pbs代替一抗作为阴性对照。

  123  免疫组织化学结果判断bcl2以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外,胞浆内无棕黄色反应物。采用hpias2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千屏影像公司)对bcl2的表达进行定量分析,每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400),测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积,计算阳性面积率(阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%)。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。

  124  统计学处理  对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和snkq检验,检验水准α为0.05。

  2  结果

  糖尿病对照组心肌细胞胞浆内无棕黄色颗粒沉积,bcl2表达弱;糖尿病补锌组和糖尿病补ve组心肌细胞胞浆内棕黄色颗粒较少,bcl2呈弱表达;糖尿病补zn+ve组心肌细胞胞浆内可见较多棕黄色颗粒,bcl2呈强阳性表达。图像分析结果显示:糖尿病对照组、糖尿病补锌组、糖尿病补ve组、糖尿病补zn+ve组平均光密度分别为0.0371±0.0113、0.0479±0.0172、0.0466±0.0168、0.2892±0.0632。糖尿病对照组、糖尿病补锌组、糖尿病补ve组、糖尿病补zn+ve组阳性面积率分别为0.0981±0.0083、0.1118±0.0173、0.1009±0.015、0.4015±0.0316。糖尿病补zn+ve组与糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补ve组之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(p<0.05);糖尿病对照组与糖尿病补锌组、糖尿病补ve组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(p>0 05),见表1。

  表1  糖尿病补zn+ve组、糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补ve组bcl2表达的平均光密度和阳性面积率(略)

  注: △ 糖尿病对照组与糖尿病补锌组、糖尿病补ve组比较,p>0.05; * 糖尿病补zn+ve组与糖尿病对照组比较,p<0.05;** 糖尿病补zn+ve组与糖尿病补锌组比较,p<0.05;# 糖尿病补zn+ve组与糖尿病补ve组比较,p<0.05。

  3  讨论

  糖尿病是一种常见的具有遗传倾向的葡萄糖代谢和内分泌障碍,是由于绝对性或相对性胰岛素分泌不足引起的。近半个世纪来,糖尿病患病率和死亡率有明显上升趋势,在我国已成为继心血管疾病、肿瘤之后列第3位的常见病、多发病和慢性非传染性疾病。糖尿病在病理组织形态上主要是由于胰岛损伤,胰岛素绝对或相对缺乏所引起[6] 。近年来,国内外许多学者经过临床和流行病学调查,以及周密设计的基础研究和实验研究,虽然对糖尿病的病因有了较多的认识,但对原发性糖尿病的病因仍然不清楚。比较一致的看法认为与遗传、环境、病毒感染、肥胖、种族、营养物质代谢和内分泌失调等因素有关。引起生物体自由基生成增多的原因与诱发糖尿病的因素存在着交叉性。当自由基在体内的产生增加时,由于其特殊的细胞毒性作用,可对机体产生一系列的损害作用,其中对胰岛β细胞的损伤是引发糖尿病的一个重要因素[7]。临床上主要分为2 型,即1 型糖尿病和2 型糖尿病,为一类常见病、多发病,发病率有愈来愈高的趋势。世界各国糖尿病患病率均上升,其中90 %为2 型糖尿病。who1997 年报告,全世界糖尿病患者1.35亿。近20年来,中国糖尿病患病率从1980年的0. 67 %上升至1997年的3.2 % ,上升近5 倍[8]。在非传染性疾病中,糖尿病死亡率仅次于肿瘤和心血管病而居第3位[9]。胰岛素治疗使糖尿病急性并发症死亡率下降,但慢性并发症死亡率却因此而上升。其根本原因在于对2型糖尿病的病因及发病机制的认识尚不清楚。关于糖尿病的发病原因,1型糖尿病已研究得较为深入,可能与hla系统、基因突变等有关。关于2 型糖目前的认识是由遗传因素与环境因素共同作用,经由胰岛素抵抗、β细胞功能减退、临床糖尿病等不同发展阶段[10]。糖尿病的发病较为复杂,了解还远远不够。糖尿病患者在无明显微血管病变时也可出现心力衰竭,表明糖尿病患者心肌细胞本身可以发生结构和功能改变,提示有心肌病的可能[11] 。糖尿病性心肌病的特征性改变为间质改变和微血管改变[12] 。karnafel[13]发现糖尿病性心肌病的病理改变有微血管变窄、微动脉瘤形成、心肌肥大、胶原结构改变、心肌纤维化及血管周的纤维化。在糖尿病性心肌病中,心脏功能改变有心绞痛、心力衰竭和心律失常,左心室舒张功能障碍是糖尿病性心肌病的早期标志之一[14] 。cai等[15] 研究发现,高血糖可直接导致活体心肌细胞凋亡,高血糖导致的心肌细胞凋亡至少部分是通过细胞色素c 激活的caspase23 途径的激活而控制。cai 等[16] 报道在糖尿病患者和动物模型中都可观察到心肌细胞死亡,通过抗氧化剂或凋亡信号途径的特异性抑制剂抑制心肌细胞死亡,可以明显的阻止糖尿病的心脏毒性,因此心肌细胞死亡在糖尿病性心肌病变中有重要作用。为阻止糖尿病的心脏毒性我们首先对糖尿病性心肌病变进行了研究,在此基础上我们采用了抗氧化剂zn+ve联合使用结果显示:光镜观察 糖尿病补zn+ve组可见心肌细胞呈短圆柱状,有分支,细胞核呈椭圆形位于中央,胞浆内可见平行排列的肌原纤维,细胞轮廓较清晰,结构较清晰。本研究结果提示: zn和ve联合使用对糖尿病大鼠心肌细胞有保护作用。

【参考文献】 ......(未完,请点击下方“在线阅读”)

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