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糖尿病大鼠心肌组织中Survivin蛋白表达的影响


□ 马计 张端莲 高凌 李培安

摘 要:

目的:研究糖尿病大鼠心肌组织中Survivin蛋白表达与糖尿病发病机制的研究。方法:按体重随机分为正常对照组(10只)和糖尿病组(20只),各组大鼠禁食12h后,实验组大鼠以60mg/kg的剂量一次性腹腔注射链脲佐菌(streptozotocin,STZ)溶液,正常对照组大鼠(NC)注射等体积的枸橼酸盐缓冲液,观察动物饮水、进食及尿量变化等情况一周后,采尾血测血糖,以血糖浓度〉16.6mmol/L、饮水量〉40ml/d、尿糖强阳性的大鼠作为糖尿病大鼠,然后将各组大鼠处死,切取心室肌组织,进行免疫组织化学实验。结果:正常对照组心肌细胞胞浆内无棕黄色颗粒,Survivin蛋白呈阴性表达;糖尿病组心肌细胞胞浆内可见密集分布的棕黄色颗粒,Survivin蛋白表达呈强阳性。图像分析结果显示,正常对照组和糖尿病组平均光密度分别为0.0792±0.0034、0.2985±0.0152,正常对照组和糖尿病组阳性面积率分别为0.1083±0.0127、0.3469±0.0168。正常对照组与糖尿病组之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(p〈0.05)。结论:Survivin蛋白对心肌细胞凋亡起着重要作用。

作者单位:武汉大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系 武汉430071

【摘要】    目的:研究糖尿病大鼠心肌组织中survivin蛋白表达与糖尿病发病机制的研究。方法:按体重随机分为正常对照组(10只)和糖尿病组(20只) ,各组大鼠禁食12h 后,实验组大鼠以60mg/kg的剂量一次性腹腔注射链脲佐菌(streptozotocin,stz)溶液,正常对照组大鼠(nc)注射等体积的枸橼酸盐缓冲液,观察动物饮水、进食及尿量变化等情况。一周后,采尾血测血糖,以血糖浓度> 16.6mmol/ l 、饮水量> 40 ml/ d 、尿糖强阳性的大鼠作为糖尿病大鼠,然后将各组大鼠处死,切取心室肌组织,进行免疫组织化学实验。结果:正常对照组心肌细胞胞浆内无棕黄色颗粒,survivin蛋白呈阴性表达;糖尿病组心肌细胞胞浆内可见密集分布的棕黄色颗粒,survivin蛋白表达呈强阳性。图像分析结果显示,正常对照组和糖尿病组平均光密度分别为0.0792±0.0034、0.2985±0.0152,正常对照组和糖尿病组阳性面积率分别为0.1083±0.0127、0.3469±0.0168。正常对照组与糖尿病组之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(p<0.05)。结论:survivin蛋白对心肌细胞凋亡起着重要作用。

【关键词】  糖尿病 心肌 survivin蛋白 免疫组化

  糖尿病(diabetes mellitus,dm)是一种多病因的代谢疾病,由于胰岛素分泌缺陷和(或)胰岛素作用缺陷从而引起糖、蛋白质、脂肪代谢异常,特点是慢性高血糖。高血糖得不到有效控制可能损害血管和神经,最终导致慢性并发症发生发展,如糖尿病视网膜病变、心血管病变、糖尿病肾病、糖尿病足、糖尿病神经病变和性功能障碍等。因此,糖尿病早期诊断和治疗可以减少发生并发症的危险性。心肌细胞凋亡不仅由特定的基因调控, 还受细胞周围的刺激信号诱导或抑制, 外源性因子可通过一定途径发挥刺激效应。目前的研究表明, 影响心肌细胞凋亡的因素很多, 归纳起来, 主要有物理性、化学性以及生物性因素3大类, 这些因素中有生理性的或病理性的, 也有促发性的或抑制性的。存活素(suvrvini)是新近发现的aip家族新成员,目前认为其可抑制凋亡信号传导通路的终末效应子caspase-3而发挥抗凋亡作用[1]。本研究采用免疫组织化学方法观察了高血糖引起的心肌细胞的凋亡作用,旨在讨论和寻找治疗糖尿病和保护心肌的实验依据。
 
  1  材料与方法

  1.1  材料
   
  实验动物  昆明种sd大鼠30只,雄性,体重180~200g ,由武汉大学医学院实验动物中心提供,适应饲养1周后进行实验。

  1.2  方法

  1.2.1  动物模型建立及分组  按体重随机分为正常对照组(10只)和糖尿病组(20只) ,各组大鼠禁食12h 后,实验组大鼠以60mg/kg的剂量一次性腹腔注射 链脲佐菌(streptozotocin ,stz)溶液(用0.1mol/ l、ph = 4.4 的构橼酸盐缓冲液在冰浴下配制成11mg/ml的stz 溶液),正常对照组大鼠(nc)注射等体积的枸橼酸盐缓冲液,观察动物饮水、进食及尿量变化等情况。一周后,采尾血测血糖,以血糖浓度> 16.6mmol/ l ,饮水量> 40 ml/ d ,尿糖强阳性的大鼠作为糖尿病大鼠,然后将各组大鼠处死,切取心室肌组织,进行免疫组织化学实验。实验期间,密切观察动物进食和饮水量变化,每周称两次体重。

  1.2.2  主要试剂  浓缩型兔抗鼠survivin单克隆抗体盒(北京中山生物技术有限公司) ;超敏即用型s-p通用型免疫组织化学试剂盒(北京中山生物技术有限公司) ;显色试盒及多聚赖氨酸(北京中山生物技术有限公司)。

  1.2.3  主要仪器  ywy781型医用微波仪(250 w,50 hz),浙江临安电子器材厂生产;家用高压锅。

  1.2.4  常规he染色  以上各组动物实验完毕后,将各组动物从心底部剪取心脏,切下心室。4%多聚甲醛固定、包埋、石蜡切片、he染色。

  1.2.5  免疫组织化学s-p法检测survivin蛋白相关抗原 
   
  主要步骤:
   
  ① 组织切片5 μm,常规脱蜡至水,蒸馏水洗;
   
  ② 3%过氧化氢,37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性,pbs洗4×5min;
   
  ③ survivin采用微波抗原修复(3档,10 min), pbs洗4×5min;
   
  ④ 正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应;
   
  ⑤ 一抗37℃孵育1h,pbs洗4×5min;
   
  ⑥ 生物素标记的二抗,37℃孵育10 min,pbs洗4×5min;
   
  ⑦ 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物37℃孵育10 min,pbs洗4×5min;
   
  ⑧ dab显色液显色,自来水冲洗终止反应;
   
  ⑨ 苏木精复染,脱水,透明,封片。
   
  用pbs代替一抗作为阴性对照。

  1.2.6  免疫组织化学结果判断 
   
  survivin蛋白以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外,胞浆内无棕黄色反应物。
   
  采用hpias-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千屏影像公司)对survivin蛋白表达进行定量分析,每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400),测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积,计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。
   
  (阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%)

  1.3  统计学处理
    
  对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和snk-q检验,检验水准α为0.05。

  2  结果
   
  正常对照组心肌细胞胞浆内无棕黄色颗粒,survivin蛋白呈阴性表达;糖尿病组心肌细胞胞浆内可见密集分布的棕黄色颗粒,survivin蛋白表达呈强阳性。图像分析结果显示,正常对照组和糖尿病组平均光密度分别为0.0792±0.0034、0.2985±0.0152,正常对照组和糖尿病组阳性面积率分别为0.1083±0.0127、0.3469±0.0168。正常对照组与糖尿病组之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(p<0.05),见表1。

  表1  正常对照组与糖尿病组心肌细胞内survivin表达的平均光密度和阳性面积率(略)

  注:*   正常对照组与糖尿病组比较,p<0.05。

  3  讨论 ......(未完,请点击下方“在线阅读”)

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