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文献检索:
  • 绒山羊FGF5基因打靶载体的构建
  • [目的]构建绒山羊FGF5基因打靶载体,以期获得基因敲除的绒山羊个体,为研究绒山羊FGF5基因的功能以及培养长绒毛型绒山羊新品种提供新思路。[方法]通过PCR法扩增并克隆了绒山羊FGF5基因启动子区和部分第一外显子的1.6 kb片段和部分第一内含子的4.5 kb片段,并将1.6 kb片段插入到打靶载体p Lox的XbaⅠ/ClaⅠ位点,获得了9.6 kb的中间打靶载体p Lox5;再将4.5 kb片段插入到p Lox5的NotⅠ位点,通过酶切和PCR法验证获得了插入方向正确的打靶载体p Lox5-33。[结果]经过酶切和PCR法鉴定,最终获得了大小为14.1 kb的p Lox5-33。[结论]成功构建了绒山羊FGF5基因包含启动子区第一外显子部分序列和第一内含子部分序列的大小为14.1 kb的基因打靶载体p Lox5-33,为进一步获得基因敲除绒山羊个体以及研究绒山羊FGF5基因的功能奠定了基础。
  • 油莎豆PEPCase基因ppc的克隆及初步分析
  • [目的]油莎豆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)基因的分子克隆及初步分析。[方法]通过对Gen Bank中其他植物PEPCase基因进行同源性比对,设计简并性引物,用PCR法克隆获得PEPCase编码基因ppc的两个片段S1和S2。[结果]S1、S2片段长度分别为577 bp和190 bp,生物信息学分析表明,S1片段全部位于ppc基因第8外显子区域,S2片段包含ppc基因第8外显子3’端序列,第9外显子5’端序列以及它们之间的内含子区域。[结论]S1、S2片段长度分别为577 bp和190 bp。Blast比对结果表明,油莎豆ppc基因S1S2全长片段与Cyperus ustulatus(PEPC-C4-1)、Cyperus longus、Cyperus iria和Cyperus papyrus的同源性均为97%,与Cyperus rotundus同源性为96%。进化树分析结果表明,油莎豆ppc基因S1和S2片段与莎草属Cyperus ustulatus、Cyperus longus、Cyperus iria等的ppc基因的进化亲缘关系最近。
  • 麦洼牦牛TF基因的克隆及蛋白质结构分析
  • [目的]探讨麦洼牦牛转铁蛋白(Transferrin,TF)的结构及生理功能。[方法]采用RT-PCR方法,从麦洼牦牛心脏克隆出TF基因,并运用多种生物信息学软件对其进行核苷酸序列及蛋白质结构分析。[结果]克隆得到的麦洼牦牛TF基因开放阅读框为780 bp,编码259个氨基酸,分子质量为28.33 k Da,理论等电点8.57,不含跨膜区域,存在信号肽序列,二级结构以随机卷曲和α-螺旋为主,无β-折叠,同源建模预测出牦牛TF蛋白与猪血清转铁蛋白有相似的三级结构,同源性可达71.91%。[结论]成功克隆了麦洼牦牛TF基因并分析了其蛋白质结构,为进一步研究TF蛋白功能提供理论基础。
  • 关岭牛MyoD基因CDS区的克隆、序列分析及其真核表达载体构建
  • [目的]通过关岭牛MyoD基因CDS区的克隆、序列分析及pcDNA3.1(+)-MyoD真核表达载体的构建,为后续研究MyoD基因的调控机制奠定基础。[方法]通过设计特异性引物克隆关岭牛MyoD基因的CDS区,并用DNAStar、Ex PASy等软件对该基因CDS区进行序列分析;同时利用双酶切的方法构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-MyoD。[结果]关岭牛MyoD基因的CDS区全长957bp,编码318个氨基酸;其编码的蛋白属于亲水性蛋白,蛋白二级结构主要以α-螺旋及无规则卷曲为主,含有b HLH结构域,无明显的跨膜区域。同源性分析显示,关岭牛MyoD基因的CDS区序列与海福特牛和山羊的同源性最高,核苷酸同源性为98.96%和96.9%,氨基酸同源性为100%和89.3%。MyoD蛋白的氨基酸肽链长度由低等动物到高等动物有逐渐加长的趋势。[结论]成功克隆了关岭牛MyoD基因的CDS区,并构建了其真核表达载体pcDNA3.1(+)-MyoD,为进一步研究MyoD基因在成肌分化过程中的作用及其调控机制奠定基础。
  • 重组铜绿假单胞菌外膜蛋白OprI的原核表达及多克隆抗体制备
  • [目的]构建铜绿假单胞菌外膜蛋白OprI原核载体,表达、纯化OprI蛋白,制备并鉴定小鼠多克隆抗体。[方法]通过分子克隆获得OprI蛋白的表达菌株;利用SDS-PAGE电泳切胶纯化、尿素梯度复性获得OprI蛋白,免疫小鼠制备OprI蛋白多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体滴度;Western blotting检测抗血清特异性;DNAMAN与MEGA软件分析OprI蛋白系统进化关系。[结果]OprI重组载体双酶切、DNA测序鉴定结果,以及蛋白表达、纯化条带大小与预测一致。ELISA法获得OprI抗血清滴度达1:3200倍,Western blotting证实抗血清具有很好的特异性。OprI序列的系统发生分析发现不同细菌存在很高的同源性。[结论]成功克隆、表达与纯化OprI蛋白,制备并鉴定小鼠多克隆抗体。为OprI蛋白免疫学功能研究奠定基础。
  • 人MTERF4基因cDNA的克隆及编码蛋白质的生物信息学分析
  • [目的]克隆人线粒体转录终止因子4(mitochondrial transcription termination factor 4,MTERF4)基因cDNA编码区,预测和分析其编码蛋白质的结构与功能。[方法]采用RT-PCR技术扩增人MTERF4基因cDNA的编码序列,采用生物信息学方法对人MTERF4蛋白进行分析。[结果]人MTERF4基因cDNA编码序列为1 146bp,编码一个由381氨基酸组成的亲水性蛋白质,分子量为45.78 k D,理论等电点为9.49。该蛋白N端1-42个氨基酸为前导肽序列,定位于细胞线粒体。其二级结构主要为α螺旋和无规则卷曲,包含4个MTERF基序。三级结构预测结果与二级结构相符。蛋白质多重序列比对和聚类分析显示,人MTERF4蛋白与大鼠、小鼠的MTERF4蛋白具有高度同源性,在系统发育树上聚为一类。[结论]人MTERF4基因cDNA的克隆及编码蛋白质的生物信息学分析为进一步研究其生物学功能奠定了理论依据。
  • 斑马鱼过氧化物还原酶的生物信息学分析
  • [目的]利用生物信息学方法分析斑马鱼过氧化物还原酶Peroxiredoxin(Prx)家族的结构和功能。[方法]基于NCBI数据库中的BLAST程序,搜索斑马鱼Prx序列,从蛋白质氨基酸序列比对、系统发育、信号肽、跨膜区、二级结构、高级结构及蛋白质相互作用等方面进行解析。[结果]斑马鱼Prx家族有6个成员(Prx1-Prx6),均含有抗氧化活性半胱氨酸Cys,不含有跨膜结构域,仅Prx4含有信号肽。Prx1-Prx4序列同源性大于50%,有共同的祖先。Prx1-Prx5可与硫氧还蛋白相互作用,Prx6可与谷胱甘肽相互作用。脯氨酸、苏氨酸和精氨酸在空间结构上与斑马鱼Prx活性半胱氨酸接近,有利于Prx抗氧化活性发挥。[结论]斑马鱼Prx蛋白结构具有脊椎动物Prx特点,具有潜在的抗氧化生物学活性。
  • Mmu-miR-107与Cacna2d1基因3'UTR结合位点的预测及验证
  • [目的]预测并验证mmu-miR-107与Cacna2d1基因3'UTR的结合位点。[方法]生物信息学预测miR-107与小鼠Cacna2d1基因3'UTR的结合位点,将包含3个靶位点的3'UTR片段克隆至荧光素酶载体p GL3中,构建野生型p GL3-Cacna2d1-WT3'UTR载体;并用重叠延伸PCR技术构建分别含有单个突变位点的载体Mut1200-207、Mut2361-367、Mut3902-908和同时含有3个突变结合位点的载体Mut4plus。将各重组质粒与miRNA mimics共转染C2C12细胞,检测荧光素酶活性。[结果]与共转染p GL3-Cacna2d1-WT 3'UTR和miR-NC组相比,共转染p GL3-Cacna2d1-WT 3'UTR和mimics-miR-107组荧光素酶活性显著下降(P〈0.01);与共转染对应的突变体和miR-NC组相比,转染突变体Mut2361-367/Mut3902-908和mimics-miR-107组的荧光素酶活性均下降(P〈0.05);转染突变体Mut1200-2077/Mut4plus和mimics-miR-107组的荧光素酶活性下降不明显(P〉0.05)。[结论]Cacna2d1基因3'UTR段双荧光素酶基因报告载体及突变体构建成功,初步证实miR-107与Cacna2d1 3'UTR的200-207位点结合。
  • 利用定量PCR测定嗜盐古菌噬菌体SNJ1的滴度
  • [目的]利用定量PCR建立检测嗜盐古生菌噬菌体SNJ1滴度的新方法,为研究高盐环境中噬菌体的动态变化提供新的途径。[方法]采用定量PCR技术检测嗜盐古菌噬菌体的gene 23上的DNA片段,通过DNA片段丰度推断噬菌体的滴度。[结果]定量PCR方法绘制的噬菌体SNJ1的标准曲线与噬菌体的滴度间有非常高的相关性(R2=0.9956),且定量PCR扩增体系效率高(99.87%),样品间的变异系数小(0.257%-3.270%),扩增特异性强(融解曲线仅有1个峰)。[结论]利用定量PCR在检测嗜盐古生菌噬菌体SNJ1滴度时表现了较高的特异性与精确性,该方法为检测高盐环境中噬菌体变化提供了一种快速、简便的手段。
  • 贵州地方山羊不同组织GnRHR mRNA表达水平研究
  • [目的]了解GnRHR基因的功能,为山羊选种选育提供更好的科学依据。[方法]采用荧光定量PCR技术分析了贵州地方山羊不同组织GnRHR基因的表达差异。[结果]黔北麻羊中子宫、下丘脑、输卵管和卵巢组织的表达量分别是是垂体组织的0.31、0.42、0.01和0.03倍。贵州白山羊和小香羊垂体组织中表达量是输卵管和卵巢组织的0.13和0.01倍;GnRHR基因在贵州黑山羊下丘脑组织中的表达量是垂体组织的5.5倍,且远高于其它组织。[结论]该研究结果将会为进一步研究该基因对山羊繁殖相关功能影响的研究奠定基础。
  • 嗜盐细菌噬菌体CJL-1的分离及其生物学特性研究
  • [目的]以嗜盐细菌为宿主,从运城盐湖水样中分离特异性噬菌体,并对其部分生物学特性进行研究。[方法]采用双层平板法分离获得噬菌体,并进行浓缩纯化。电镜观察噬菌体形态,以及限制性酶切分析、蛋白组成分析及特性研究。[结果]分离获得1株可感染Virgibacillus sp.GQ15的噬菌体CJL-1,其头部为正多面体结构,直径约110 nm,尾长约25 nm。其基因组为双链DNA,且衣壳中至少含有10种蛋白质,其中4种为主要结构蛋白:75 k Da、45 k Da、25 k Da和15 k Da。噬菌体CJL-1含有脂质包膜,且对低盐环境敏感。CJL-1最适MOI为1.0,最适保存温度为30~50℃,最适感染p H为7,且其宿主范围较广。[结论]噬菌体CJL-1属短尾噬菌体,为裂解性嗜盐噬菌体,研究结果可为运城盐湖极端微生物资源的开发利用提供参考。
  • 纳米银抑制铜绿微囊藻的机理研究
  • [目的]纳米银可以抑制铜绿微囊藻的繁殖及减少其叶绿素a的合成,但具体机理还不清楚,该研究探讨纳米银抑制铜绿微囊藻的生化和分子机理。[方法]用琼脂糖凝胶电泳法检测了经纳米银作用后铜绿微囊藻基因组的降解情况,用硫代巴比妥酸(TBA)法检测了细胞膜氧化产物丙二醛(MDA)的含量及用实时荧光定量PCR检测了叶绿素a合成基因chl L的表达量的变化。[结果]经纳米银作用后的铜绿微囊藻的基因组电泳图显示相对严重的断裂现象,丙二醛含量明显增多,叶绿素合成基因chl L的表达量也显著下降。[结论]纳米银可以损坏铜绿微囊藻的细胞膜与基因组,进而影响基因表达,使叶绿素合成相关的chl L基因表达量显著下降,抑制铜绿微囊藻的繁殖,甚至致其死亡。
  • 重组芋螺毒素His-Xa-MrVIB分泌表达研究
  • [目的]利用简单快速的基因工程法来生产富含二硫键的芋螺毒素Mr VIB,寻找有效合成具有天然活性芋螺毒素的新途径。[方法]人工设计合成芋螺毒素Mr VIB基因引物来构建表达载体p ET22b(+)/His-Xa-Mr VIB,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)plys S进行诱导表达。再利用Ni-NTA琼脂糖柱进行亲和层析纯化重组蛋白,Tricine-SDS-PAGE电泳分析重组蛋白表达形式。[结果]重组芋螺毒素His-Xa-Mr VIB(r His-Xa-Mr VIB)在大肠杆菌中获得有效分泌表达,经一步亲和层析获得纯度大于90%的重组芋螺毒素。[结论]基因工程方法能够有效分泌表达芋螺毒素Mr VIB,解决化学合成芋螺毒素产量低、成本高、难以纯化等问题。
  • 小鼠肝纤维化中内质网应激分子的表达与作用
  • [目的]利用高脂饲料和异种血清诱导建立肝纤维化模型,检测内质网应激分子在该纤维化模型中的作用及机制。[方法]收集各组小鼠血清进行ALT检测,对小鼠肝组织进行HE和Masson染色观察肝组织的结构变化以及胶原纤维状况,并分别用Western和RT-PCR检测组织内CRT、GRP78、TLR2等基因的表达。[结果]与正常对照组(48.8±6.1 U/L)相比高脂饲料饮食组(139.7±13.4 U/L)、腹腔注射异种血清组(72.8±7.2U/L)以及高脂饲料联合腹腔异种血清注射组(193.0±14.1 U/L)血清ALT显著升高(p〈0.05);镜下也观察到肝细胞脂肪变性,大量的胶原纤维产生;肝组织内GRP78和TLR2基因mRNA水平、CRT蛋白水平均升高(p〈0.05)。[结论]高脂饲料和异种血清诱导建立的肝纤维化模型显示内质网应激与肝纤维化的发生发展密切相关。
  • 泡菜生香酵母的分离鉴定与挥发性香气成分分析
  • [目的]研究特定生香酵母的挥发性香气,提升泡菜发酵的香气质量。[方法]从川南农家泡菜中筛选出一株生香酵母Y7,依据形态学和26S r DNA法鉴定该菌,并采用HS-GC-MS的方法分析其挥发性香气。[结果]系统发育树结果表明Y7与Kazachstania barnettii有高达99%的可信度。其挥发性香气成分有9种,主体挥发性香味是乙酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基丁醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇和苯乙醇,尤其是苯乙醇相对含量高达24.225%。[结论]为Kazachstania barnettii应用在泡菜发酵增香奠定基础。
  • 液相芯片技术抗体修饰制备条件的优化
  • [目的]优化以琼脂糖水凝胶包裹的光子晶体为载体的液相芯片抗体修饰制备方法,提高抗体修饰密度及检测灵敏度。[方法]选取人Ig G作为待检靶蛋白,在琼脂糖水凝胶上首先固定羊抗人Ig G抗体,经过洗涤、封闭后,依次加入标准抗原、荧光标记的检测抗体,分别孵育、洗涤后,倒置荧光显微镜获取图像及荧光强度,根据荧光强度优化最佳琼脂糖水凝胶浓度、固定时间、氢氧化钠浓度、环氧氯丙烷浓度以及抗体浓度。[结果]在水凝胶浓度4%、Na OH浓度1.0mol/L、环氧氯丙烷浓度10%、反应时间3h、抗体浓度0.01mg/ml的条件下,荧光强度达到最强,即抗体修饰密度达到最大。[结论]该研究优化了以琼脂糖水凝胶包裹的光子晶体为载体的抗体修饰反应条件,提高了液相芯片检测的灵敏度。
  • 黑曲霉固态发酵苹果渣生产木聚糖酶与β-甘露聚糖酶
  • [目的]采用黑曲霉固态发酵苹果渣生产木聚糖酶与β-甘露聚糖酶,以降低生产成本,同时提高苹果渣的综合利用水平。[方法]采用单因素试验和响应面法对固态发酵工艺进行优化。[结果]培养基最佳组成为苹果渣60%(W/W)、棉粕40%(W/W)、(NH4)2SO41.36%(W/W)、KH2PO40.076%(W/W)、初始含水量55.6%(W/W),最佳培养温度为27.5℃;在所优化的条件下发酵48h,木聚糖酶活力可达5736 U/g,β-甘露聚糖酶活力可达896.24 U/g;培养物中自由棉酚残留量为24.6μg/g,低于饲料中自由棉酚的安全标准。[结论]采用黑曲霉固态发酵苹果渣生产木聚糖酶与β-甘露聚糖酶是可行的,发酵产物可用作饲料添加剂。
  • 响应面法优化油茶炭疽病拮抗细菌R6发酵条件
  • [目的]为了获得拮抗细菌R6的最佳发酵条件,提高其对油茶炭疽病菌的抑菌活性。[方法]采用响应面分析法对拮抗细菌R6发酵条件进行了优化。首先通过Plackett-Burman试验筛选出对菌体浓度影响较大的3个重要因素即初始p H、摇床转速、培养温度,最后应用响应面法进行分析。[结果]菌株R6的最佳发酵条件为:初始p H8.10、培养温度30.30℃、摇床转速171.00r/min、接种量5%、培养时间24h,此时,发酵液的OD600为1.915,与模型的预测值基本相符。优化后菌体浓度和对油茶炭疽病菌的抑菌率较优化前分别提高了9.56%和12.24%。[结论]响应面法优化得到的R6的发酵条件参数准确,该模型可以用于R6菌株发酵条件的优化。
  • TRIM72蛋白结构及功能研究进展
  • TRIM72蛋白是一个新发现的三重基序(tripartite motif,TRIM)家族蛋白,它由一个RING finger、一个B-box motif、一个coiled-coil region和羧基端的一个PRY-SPRY结构域构成。TRIM72蛋白在肌肉组织中参与肌细胞损伤后的膜修复过程,在心脏中参与抵抗心脏缺血/再灌注损伤等,并与肌细胞中的胰岛素信号通路之间存在关联性。虽然它仅在骨骼肌和心肌中特异性表达,但人们在一些其他种类的细胞中也观察到它的生理功能。此文从结构和功能的角度介绍TRIM72蛋白的研究进展,并针对TRIM72蛋白未来的研究和应用等方面进行了初步讨论。
  • 天然抗菌肽的结构改造研究进展
  • 抗菌肽是一类小分子多肽类物质,由10-50个氨基酸组成,具有广谱的抗菌特性,由于其机制与一般抗生素不同,故不易使病原菌产生耐药性,因此抗菌肽有望被开发成为新一代肽类抗生素。但抗菌肽的稳定性差、溶血毒副作用强、治疗指数低等缺点限制了其进一步发展,所以,近年来对抗菌肽的结构改造已成为研究热点。该文主要从抗菌肽的二级结构、结构改造及抗菌肽机制研究三方面进行了综述,并对抗菌肽在结构改造中存在的问题加以分析,为更好地把握和设计新型抗菌肽奠定基础。
  • [论著]
    绒山羊FGF5基因打靶载体的构建(郭慧琴;苏少锋[1,2];任卫波;尹俊)
    油莎豆PEPCase基因ppc的克隆及初步分析(敬思群;于红;涂亦娴;艾百拉·热合曼)
    麦洼牦牛TF基因的克隆及蛋白质结构分析(段荟芹;王利;李键;钟金城;字向东;江明锋;熊显荣;李雪峰)
    关岭牛MyoD基因CDS区的克隆、序列分析及其真核表达载体构建(张雯;许厚强;陈伟[1,2];陈祥;桓聪聪[1,2];夏丹;周迪)
    重组铜绿假单胞菌外膜蛋白OprI的原核表达及多克隆抗体制备(陈春琳;刘祥;王成富;王令;俱雄;张涛;吴三桥;张晓娟)
    人MTERF4基因cDNA的克隆及编码蛋白质的生物信息学分析(熊伟[1,2];杨勇琴;张海洋;徐彤;张晓娟;余敏)
    斑马鱼过氧化物还原酶的生物信息学分析(孙晶;薛壮)
    Mmu-miR-107与Cacna2d1基因3'UTR结合位点的预测及验证(阮杰[1,2,3,4];翁亚光;赵炜[1,4];熊兴东[1,3,4];张春龙[1,3,4];李江滨[1,2];刘桂平;黄池荣;付思莹;刘新光[1,2,3,4])
    [技术与方法]
    利用定量PCR测定嗜盐古菌噬菌体SNJ1的滴度(何聪聪;黄咏驰;胡纯;沈萍;梅运军)
    贵州地方山羊不同组织GnRHR mRNA表达水平研究(龙威海;张劲松;许厚强;冯文武;丁玫;陈祥)
    嗜盐细菌噬菌体CJL-1的分离及其生物学特性研究(于慧瑛;曹建斌;李新)
    纳米银抑制铜绿微囊藻的机理研究(郝从芳;金新;沈志凯;李存治;毛灵琪;闫达中)
    [开发与应用]
    重组芋螺毒素His-Xa-MrVIB分泌表达研究(高炳淼;刘云海;魏娜;谭银丰;钟霞;张俊清)
    小鼠肝纤维化中内质网应激分子的表达与作用(田慧群;吴薇;邹晓华;王雅琴;张伟;任东明;刘朝奇)
    泡菜生香酵母的分离鉴定与挥发性香气成分分析(龚加路;吴华昌;邓静;张静;赵兴秀;赵长青;邹伟)
    液相芯片技术抗体修饰制备条件的优化(凌云[1,2];孔欣;陈宝安)
    黑曲霉固态发酵苹果渣生产木聚糖酶与β-甘露聚糖酶(王维超;辛寒晓;王泽利;师广波;孙中涛)
    响应面法优化油茶炭疽病拮抗细菌R6发酵条件(左杰;周国英;田媛媛;刘慧娟)
    [专题综述]
    TRIM72蛋白结构及功能研究进展(万婵娟;王玉娟)
    天然抗菌肽的结构改造研究进展(刘倍均;姚佳;倪京满)
    《生物技术》封面

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