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文献检索:
  • 人claudin-10基因启动子转录调控的初步分析
  • [目的]构建不同长度的人claudin-10基因上游启动子荧光素酶报告基因载体,并在LO2细胞中比较其活性。[方法]以人LO2肝细胞基因组DNA为模板,PCR扩增获得claudin-10基因5'侧翼序列,并将其插入p MD18-T载体;PCR扩增获得不同长度的claudin-10基因上游启动子区序列,构建p GL3-Basic系列荧光素酶基因报告载体。瞬时转染LO2细胞,双荧光素酶报告基因分析系统检测转录活性。[结果]成功构建6个不同长度的人claudin-10基因上游启动子区(-1 451/+100bp、-1 022/+100bp、-1 005/+100bp、-677/+100bp、-377/+100bp和-108/+100bp)的报告载体;启动子活性实验结果表明:当claudin-10启动子片段从-1 005 bp截短至-677 bp,从-108 bp截短至+100 bp时活性显著下降(P〈0.05);其余截短时活性无改变(P〉0.05)。[结论]claudin-10启动子-1 005bp~-677bp和-108bp~+100bp区是claudin-10基因的主要转录调控区。
  • 印度节旋藻TJSD rpoC1基因部分序列的克隆与分析
  • [目的]为进一步明确TJSD藻株的分类学地位,寻找用于螺旋藻、节旋藻分类的新靶标分子。[方法]采用PCR技术对印度节旋藻TJSD藻株的rpoC1基因进行扩增,利用相关生物信息学数据库及软件对其序列进行了分析。[结果]获得的rpoC1基因编码区片段长度为966 bp,GC含量为47.41%,由此推导的氨基酸的理论相对分子质量为29.16 kD,其中酸性、碱性、疏水性氨基酸的比例分别为14.29%、16.77%、42.86%,与其它蓝藻同源序列的相似度在76%~99%之间。该藻株与Arthrospira sp.PCC8005藻株的遗传距离仅为0.001,在NJ树中聚在一起,且得到了100%的支持率,与蓝藻中其它属明显分为了不同的类群。[结论]TJSD为节旋藻属且rpoC1基因序列可在属及其以上水平用于节旋藻系统发育分析。
  • 黑曲霉木聚糖酶Xyn43A基因的克隆和生物信息学分析
  • [目的]克隆黑曲霉木聚糖酶(Xyn43A)基因,进一步对其进行生物信息学分析。[方法]利用3'RACE与5'RACE技术,克隆Xyn43A全长cDNA序列,扩增Xyn43A的DNA序列,并进行序列分析。[结果]cDNA全长1152bp(不含Poly(A)),包含一个957bp开放阅读框,编码信号肽19个氨基酸,成熟肽299个氨基酸,5'与3'非编码区分别为113bp、82bp。预测该蛋白相对分子量为33.47kDa,等电点为4.55。该序列含一个长度为86bp的内含子。Xyn43A为亲水性稳定蛋白,有4个N-糖基化位点,26个磷酸化位点。与GH43族木聚糖酶亲缘性较近,具有GH43族糖基水解酶典型的5叶片螺旋桨结构。[结论]克隆了一个新的木聚糖酶基因,属于GH43族糖基水解酶。
  • 人Notch配体DLL4基因的克隆及真核表达
  • [目的]构建真核重组质粒DLL4/pCMV-Tag4并进行瞬时表达,为进一步研究DLL4/Notch信号通路奠定基础。[方法]采用PCR的方法扩增人DLL4基因,并克隆于真核表达载体pCMV-Tag4中,通过酶切和测序鉴定后,瞬时转染HEK293 T细胞,荧光定量PCR和Western blot鉴定人DLL4的表达。[结果]成功构建了DLL4/p CMV-Tag4重组质粒并在HEK293T细胞中表达。[结论]人DLL4在HEK293T细胞中表达,为进一步研究DLL4/Notch信号通路奠定基础。
  • 家蚕二分浓核病毒VD1-ORF4基因在两类表达系统中的表达分析
  • [目的]为获得家蚕二分浓核病毒(Bm BDV)VD1-ORF4编码的可溶性蛋白,对该序列在两类表达系统中进行表达。[方法]在原核系统中,将靶基因克隆入载体p MAL-c2X中,使麦芽糖标签序列与靶基因5’端融合,将融合后的重组质粒转化大肠杆菌BL21,进而对其进行IPTG诱导,对诱导后的表达产物进行Western blotting分析;在真核表达系统中,以笔者实验室改造的Ac-Bacmid为分子载体,通过转座,将多角体启动子控制的VD1-ORF4表达盒定点插入到载体中,在脂质体的介导下,将整合型重组杆粒转染Sf-9细胞,将转染上清感染Sf-9细胞,并对其总蛋白进行Western blotting分析。[结果]在两类表达系统中,都只鉴定到Bm BDV VD1-ORF4部分序列的表达,其融合表达产物大小都约70 kDa。[结论]获得Bm BDV VD1-ORF4截短蛋白,为其功能研究奠定基础。
  • 鸡碳酸酐酶4基因在毕赤酵母中的表达
  • [目的]通过毕赤酵母的表达获得鸡碳酸酐酶4(CAⅣ)蛋白。[方法]根据鸡CAⅣ的序列,结合毕赤酵母密码子的偏好性,合成CAⅣ基因。将CAⅣ基因克隆到pPICZαA真核表达载体,获得重组表达质粒pPICZαA-CAⅣ。将其电转毕赤酵母GS115后,获得重组毕赤酵母菌GS115/pPICZαA-CAⅣ。用终浓度为1%的甲醇对重组阳性菌进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Westernblot法检测蛋白的表达,并用Ni离子亲和层析法对表达出的蛋白进行纯化。[结果]成功构建了表达载体pPICZαA-CAⅣ,转化重组酵母菌后可分泌出36kDa左右的CAⅣ蛋白,并通过Ni离子亲和层析法获得了单一性的目的蛋白CAⅣ。[结论]获得分子量约36kDa的鸡CAⅣ蛋白。
  • GST-Ets-1融合蛋白的表达与纯化
  • [目的]旨在原核表达Ets-1基因,纯化获得GST-Ets-1融合蛋白。[方法]以SD大鼠脑垂体cDNA为模板,利用PCR扩增含有Bam HI和Not I酶切位点的Ets-1基因;然后将其克隆到pGEX-4T-1原核表达载体中,将正确的重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3);用IPTG诱导表达,再利用Magne GST particles亲和纯化GST-Ets-1融合蛋白;最后通过Western blot鉴定此融合蛋白。[结果]成功构建pGEX-4T-1-Ets-1原核表达载体;30℃条件下,0.2 mmol/L的IPTG能诱导出大量的可溶性GST-Ets-1蛋白;经Magne GST particles纯化的GST-Ets-1蛋白可被识别ETS-1的抗体特异识别。[结论]纯化的GST-Ets-1蛋白可用于后续的生物学研究。
  • 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及定位
  • [目的]在Bm N细胞中表达家蚕二分浓核病毒(Bombyx mori bidensovirus,Bm BDV)非结构蛋白NS1,并分析其亚细胞定位。[方法]在病毒非结构蛋白NS1基因5'端加上kozak序列、3'端融合Flag标签序列;将重组序列克隆至昆虫细胞表达载体pIBV5/His上,转染BmN细胞,通过Western blot和免疫荧光检测NS1蛋白的表达和亚细胞定位。[结果]PCR和酶切鉴定显示重组表达载体构建正确;Western blot检测到一条大小约37 kDa的特异条带,免疫荧光分析显示表达的蛋白主要定位于细胞核中。[结论]构建的真核表达质粒能在BmN细胞中稳定表达NS1蛋白,该蛋白主要定位在细胞核中。
  • 川芎咖啡酸-3-O-甲基转移酶的同源建模与分子模拟对接
  • [目的]分析川芎咖啡酸-3-O甲基转移酶(Caffeic acid-3-Omethyltransferase,COMT)序列特征、蛋白结构和活性位点。[方法]以紫花苜蓿中COMT的晶体结构为模板,利用同源建模构建川芎(Ligusticum chuanxiong Hort)COMT的三维模型。[结果]经过动力学优化后,川芎COMT的三维模型与紫花苜蓿COMT的结构极为相似,主要由α-螺旋和β-折叠构成,其中α-螺旋占37.26%、β-折叠占10.41%、无规卷曲占52.33%。川芎COMT含有两个重要的结构域:咖啡酸结合域与S-腺苷甲硫氨酸结合域,主要通过氢键与范德华力结合,其中咖啡酸与川芎COMT分子中的Asp208和Gly210形成氢键,S-腺苷甲硫氨酸与川芎COMT分子中的Ser186、Thr213、Ala215、Thr216、Trp268及Asp272等残基形成氢键。[结论]该文得到川芎COMT的序列特征、蛋白结构和活性位点,为该类COMT的催化机理研究和分子工程改造奠定基础。
  • 南药益智AFLP-PCR体系的建立与优化
  • [目的]建立适合南药益智的扩增片段长度多态性(AFLP)扩增体系来研究不同地理居群益智遗传多样性。[方法]利用植物基因组试剂盒法提取高质量的益智基因组DNA,采用单因素和正交试验对AFLP过程中的酶切和PCR相关影响因素进行优化,并对适合益智AFLP分析的引物组合进行筛选。[结果]实验结果表明最佳酶切反应体系:模板DNA 0.6μg,酶量20 U,酶切时间2 h;最佳AFLP-PCR选择性扩增反应体系(总体积为25μL):10×PCR Buffer(不含Mg2+)2.5μL,d NTPs 2μL,Mg2+(25mmol/L)1.5μL,引物(10 pmol/μL)各2.0μL,Taq酶(5 U/ml)0.5μL,模板稀释25倍2μL。利用建立的最佳扩增体系从64对引物中筛选获得8对选择性引物适合益智AFLP分析。[结论]建立了稳定的AFLP-PCR体系,为研究益智遗传多样性的AFLP分析奠定了基础。
  • 肠炎沙门菌lpfC基因缺失株的构建及基本生物学特性研究
  • [目的]为研究与Lpf菌毛合成相关的lpfC基因对肠炎沙门菌致病性的影响。[方法]利用自杀质粒介导的同源重组技术构建肠炎沙门菌C50041株的lpfC基因缺失株C50041ΔlpfC,并进行PCR和测序鉴定。同时,将lpfC基因克隆至质粒pBR322并电转入缺失株中,构建回复株C50041ΔlpfCR。比较野生株C50041、缺失株C50041ΔlpfC及回复株C50041ΔlpfCR的基本生物学特性。[结果]成功构建了缺失株C50041ΔlpfC及回复株C50041ΔlpfCR,且lpfC基因的缺失不影响C50041的生长特性和生化特性。该缺失株具有良好的遗传稳定性,但缺失株对BALB/c小鼠的LD50是野生株的2倍。[结论]lpfC基因的缺失使肠炎沙门菌对BALB/c小鼠的毒力降低,为进一步研究肠炎沙门菌Lpf菌毛的功能奠定了基础。
  • 从江香猪MC4R基因多态性及生物信息学分析
  • [目的]旨在对3个群体猪MC4R基因进行SNPs筛选,为从江香猪选种选育提供一定的理论基础。[方法]以从江香猪作为研究对象,野猪×从江香猪二元杂交猪和杜×大×长外三元杂交猪作为对照,构建品种DNA池,PCR扩增MC4R基因外显子、内含子和3’非编码区序列,采用直接测序法对3个群体的MC4R基因进行单核苷酸多态性检测,利用生物信息学软件预测不同多态性位点对MC4R基因mRNA二级结构和蛋白质二级结构的影响。[结果]在3个群体中共检测出10个SNPs位点,其中,C860T、G1392A和G1577A位于第2外显子区;G1699A、T1702A、A1870C、G1875A、C2025T、G2073A和A2111T位于3’非编码区序列。C860T为同义突变,G1392A和G1577A为错义突变,分别导致了精氨酸变为组氨酸、天冬氨酸变为天冬酰胺。经分析软件预测,处于第二外显子中的3个SNPs位点对MC4R基因的mRNA二级结构、蛋白质二级结构有一定的影响。[结论]DNA池结合测序技术检测到MC4R基因外显子、内含子和3’非编码区序列共10个SNPs。
  • 禾谷炭疽菌磷酸二酯酶生物信息学分析
  • [目的]磷酸二酯酶(Pde)作为G蛋白信号传导途径上的效应酶,发挥着重要作用。该酶已在粟酒裂殖酵母菌、稻瘟病菌等中有相关报道。通过对禾谷炭疽菌中Pde生物信息学分析,以期为深入开展该蛋白定位、功能研究等方面研究,以及实现以控制病原菌G蛋白信号途径功能新的药物靶标的开发提供有力的理论支撑。[方法]基于酿酒酵母中已经报道的典型Pde序列,利用Blastp以及关键词对禾谷炭疽菌蛋白质数据库进行比对、搜索,并通过SMART保守结构域分析、理化性质、疏水性、细胞信号肽、跨膜区结构、亚细胞定位以及二级结构等生物信息学分析,此外,通过对禾谷炭疽菌中的典型Pde与其他物种中的同源序列进行遗传关系比较分析。[结果]明确禾谷炭疽菌中存在2个Pde,上述Pde均含有最低比例的色氨酸,均属于亲水性蛋白,均不含有信号肽以及均定位于细胞质等特征。[结论]通过对比,发现禾谷炭疽菌、酿酒酵母中的Pde具有诸多相同性质,提示不同真菌之间存在的保守性。
  • 陕西汉中古旱莲内生真菌的多样性研究
  • [目的]了解古旱莲(Magnolia denudate Dest var.purpurascens Rehd et Wils)内生真菌组成及多样性。[方法]纯培养分离古旱莲内生真菌,提取菌株DNA,用真菌通用引物ITS1/ITS4进行28S rRNA序列扩增,提交测序分析,构建系统发育树。[结果]共分离内生真菌122株,共67个形态类群,根据测序结果不同,将菌株归为16个分类单元(OUT)。系统发育学分析表明,这些菌株分属5个门,半知菌亚门(Deuteromycotina)下6个分类单元,占总数的65.7%;子囊菌亚门(Ascomycota)下6个分类单元,占总数的22.4%;担子菌亚门(Basidiomycota)下2个分类单元,占总数的5.9%;接合菌亚门(Zygomycota)下2个分类单元,占总数的2.9%;球囊菌门(Glomeromycota)下1个分类单元,占总数的2.9%。[结论]从古旱莲中分离到内生真菌122株,分别属于5个门,古旱莲内生真菌多样性丰富。
  • 梯度稀释及微量点样法在环境γ-变形菌分离中的应用
  • [目的]细菌分离中,梯度稀释及微量点样法可较好地保持细菌的原位丰度,理论上对优势菌的分离有较高的概率;应用梯度稀释及微量点样法分离γ-变形菌是一个有趣的研究点。[方法]应用梯度稀释及微量点样法,结合不同的分离条件,对7种环境样品进行γ-变形菌分离。[结果]从7种环境样品中成功分离52株细菌,经鉴定γ-变形菌为42株,占分离细菌总数的80.77%,呈现明显的γ-变形菌偏好性;已获得的γ-变形菌分属于8个不同的属,优势菌属为Klebsiella、Enterobacter、Escherichia,占已分离γ-变形菌的78.58%。[结论]实验所应用的梯度稀释及微量点样法对γ-变形菌的分离呈明显的偏好性(P〈0.05),是环境γ-变形菌分离方法的重要补充,该方法适用于环境优势菌的分离尝试。
  • L-色氨酸基因工程菌发酵培养基配方优化研究
  • [目的]对L-色氨酸基因工程菌液态发酵的培养基进行优化。[方法]通过P-B试验,筛选出对基础发酵培养基的发酵液中L-色氨酸浓度影响显著的因素,进一步通过最陡爬坡试验、B-B试验对影响显著的因素进行优化。在此基础上,确定最佳的发酵培养基配方。[结果]酵母粉、Fe SO4·7H2O、KH2PO4对发酵液中L-色氨酸浓度的影响显著;最佳培养基配方为:Glucose 25.0 g/L,酵母粉4.5 g/L,(NH4)2SO49.0 g/L,Mg SO44.5 g/L,柠檬酸钠2.0 g/L,Fe SO4·7H2O 96.1 m g/L,KH2PO41.2 g/L。[结论]根据此配方进行验证实验,发酵液中L-色氨酸浓度可达2.25 g/L。
  • 响应面分析法优化海马多糖提取工艺
  • [目的]对中药海马多糖的提取工艺进行优化。[方法]通过单因素试验研究水料比、提取温度、功率和时间对海马多糖得率的影响,在此基础上,采用Box-Behnken设计响应面实验,以海马多糖得率为响应值作响应面和等高线图,优化确定最佳工艺条件。[结果]海马多糖优化后的提取工艺条件:水料比8:1,温度50℃,功率60 W,时间40 min。[结论]优化后的最佳条件能提高海马多糖得率,在此条件下海马多糖平均得率为11.37%,该提取工艺稳定可行,实验测得值与预测值基本吻合。
  • 高活性大豆异黄酮发酵豆粕体外抗氧化能力研究
  • [目的]研究高活性大豆异黄酮发酵豆粕(HSMF)的体外抗氧化能力。[方法]选取HSMF、普通发酵豆粕(SMF)和普通豆粕(SM)三种材料,分别制备不同浓度发酵豆粕的大豆异黄酮(SIF)提取液,测定其体外抗氧化能力及苷元转化效率。[结果]发现1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)清除力和还原力与SIF浓度呈正相关,羟基自由基清除力和超氧阴离子清除力随着浓度的升高而升高,达到一定浓度后保持稳定。当在浓度为100%时,HSMF、SMF、SM的DPPH清除力分别为58.56%、45.32%和31.01%,还原力分别为1.04、0.80和0.44,羟基自由基清除力分别为78.56%、70.54%和65.42%,超氧阴离子清除率分别为61.59%、49.21%和17.53%,苷元型异黄酮所占比例分别为18.84%、50.90%和85.62%。[结论]利用复合益生菌发酵后的豆粕抗氧化能力显著高于SMF及SM(P〈0.05)。
  • 富含甘氨酸抗菌肽的研究进展
  • 抗菌肽是机体先天免疫的重要组成部分,种类繁多。其中富含甘氨酸抗菌肽广泛存在于多种生物体,具有广谱抗菌活性,并且在药物治疗、农业、食品业等方面已经取得一定成绩,该文根据近年抗菌肽研究成果,综述了富含甘氨酸抗菌肽的分类、作用机制、存在的问题和应用前景。
  • [论著]
    人claudin-10基因启动子转录调控的初步分析(周雯;王青松)
    印度节旋藻TJSD rpoC1基因部分序列的克隆与分析(吴跃梅;董世瑞;王博彦;魏娟;王素英)
    黑曲霉木聚糖酶Xyn43A基因的克隆和生物信息学分析(周晨妍;王燕;朱新术;刘振华;李同彪)
    人Notch配体DLL4基因的克隆及真核表达(叶建斌;梁来妹;陈中标;杨宜;宁立军;李妍;宁云山[1,2])
    家蚕二分浓核病毒VD1-ORF4基因在两类表达系统中的表达分析(李国辉;周倩;徐五;胡朝阳;姚勤)
    鸡碳酸酐酶4基因在毕赤酵母中的表达(聂彬;黄华榕;韩燕国;姜勋平;刘桂琼)
    GST-Ets-1融合蛋白的表达与纯化(刘莉;单大鹏;罗汉将;李岳亭;杨予涛;徐志卿)
    家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及定位(张清;张晓龙;李国辉;姚勤;胡朝阳)
    川芎咖啡酸-3-O-甲基转移酶的同源建模与分子模拟对接(宋涛;冯斌;李娟娟;唐迪;王万军;廖海;周嘉裕;谭睿)
    [技术与方法]
    南药益智AFLP-PCR体系的建立与优化(高炳淼[1,2];潘坤[1,2];田建平;唐天乐;魏娜[1,2];张俊清[1,2])
    肠炎沙门菌lpfC基因缺失株的构建及基本生物学特性研究(王晓春;焦扬;程瞾;吴颖斐;康喜龙;胡亚辰;李求春;焦新安)
    从江香猪MC4R基因多态性及生物信息学分析(张雄;张勇;李俊;杨红;彭松;何琦;张宇君)
    禾谷炭疽菌磷酸二酯酶生物信息学分析(韩长志)
    陕西汉中古旱莲内生真菌的多样性研究(王菲;兰阿峰[1,2];郭素芬;刘栋;邓百万[1,2];解修超[1,2])
    [开发与应用]
    梯度稀释及微量点样法在环境γ-变形菌分离中的应用(舒青龙;封勇;左爱仁;冯洁)
    L-色氨酸基因工程菌发酵培养基配方优化研究(罗建成;李杰;程爽;王莹)
    响应面分析法优化海马多糖提取工艺(魏娜[1,2];魏晴;杨柳;王勇)
    高活性大豆异黄酮发酵豆粕体外抗氧化能力研究(殷晓风;丁瑞志;蔡旋;方华;徐建雄)
    [专题综述]
    富含甘氨酸抗菌肽的研究进展(海力且木·艾力;刘忠渊)
    《生物技术》封面

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