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文献检索:
  • 人PSCA和PAP融合基因真核表达质粒的构建与表达
  • [目的]构建人PSCA和PAP融合基因的真核表达质粒,并在体外进行表达和鉴定。[方法]设计并合成人PSCA和PAP融合基因,然后将其定向克隆到真核表达载体p IRES-neo中,双酶切鉴定后,将重组质粒p IRES-neoPSCA-2A-PAP瞬时转染293T细胞,采用流式细胞术和免疫荧光细胞化学技术验证其表达。[结果]构建了p IRES-neo-PSCA-2A-PAP真核表达质粒,流式细胞术和免疫荧光细胞化学技术结果显示融合抗原可以在293T细胞表达,阳性率高达67.85%。[结论]成功构建了融合抗原PSCA与PAP的真核表达质粒p IRES-neo-PSCA-2A-PAP,为建立稳定转染人PSCA和PAP融合基因的细胞系奠定了基础。
  • 人可溶性VEGFR2和IL-12融合基因真核表达质粒的构建与表达
  • [目的]构建和表达人可溶性血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)与白细胞介素12(IL-12)融合基因的真核表达质粒,并初步验证其抗肿瘤活性。[方法]根据Gen Bank公布的基因序列,设计并分别全基因合成全长人VEGFR2和IL-12基因,VEGFR2与IL-12通过Furin/2A(F2A)进行连接,融合基因克隆入真核表达载体p VAX1,构建p VAX1-VEGFR2-F2A-IL-12表达质粒。将p VAX1-VEGFR2-F2A-IL-12质粒瞬时转染293T细胞后,通过ELISA法测其真核表达能力。质粒注射B16荷瘤小鼠模型后,分析其抗肿瘤效果。[结果]质粒p VAX1-VEGFR2-F2A-IL-12构建成功;ELISA检测293T细胞转染上清液结果显示,VEGFR2和IL-12都能够在293T细胞中得到表达。质粒注射荷瘤小鼠模型后,显示出了较强的抑制B16肿瘤生长的能力,达到50%。[结论]p VAX1-VEGFR2-F2A-IL-12质粒成功构建和表达,该质粒具有较好的抑制B16肿瘤生长的能力,其抑制率达50%。
  • 线粒体自噬受体Bnip3的载体构建及蛋白表达纯化
  • [目的]获得可用于蛋白晶体筛选的高纯度Bnip3蛋白。[方法]将Bnip3截断基因构建到原核表达载体上并转化大肠杆菌。IPTG诱导表达后通过GST柱纯化目标蛋白。TEV酶切除GST标签后采用凝胶过滤层析纯化Bnip3蛋白。[结果]Bnip3截断基因重组体成功构建并诱导表达目标蛋白。通过GST亲和层析得到可溶性的携带GST标签的Bnip3(1~111)和Bnip3(1~152)蛋白。切除GST标签的Bnip3(1~152)通过凝胶过滤层析得到构象均一的二聚体蛋白。[结论]采用原核表达、亲和层析和凝胶过滤层析可获得构象均一的高纯度二聚体Bnip3蛋白。
  • Carboxin抗性基因(Cbx^R)原核表达及多克隆抗体的制备
  • [目的]克隆CbxR基因,进行原核表达,纯化CbxR基因蛋白并制备其多克隆抗体。[方法]CbxR基因克隆至原核表达载体p ET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达并纯化,Western blot鉴定分析。制备CbxR蛋白的兔源多克隆抗体,运用间接ELISA方法检测多抗效价,利用Western blot印记检测抗体特异性。[结果]成功获得CbxR基因,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导可大量表达,成功制备CbxR蛋白兔源多克隆抗体,效价为1∶64 000,经Western blot检测表明多克隆抗体特异性良好。[结论]多克隆抗体为CbxR检测及进一步研究CbxR基因功能奠定了基础。
  • tap基因靶向表达导致果蝇神经系统异常发育
  • [目的]果蝇tap基因编码进化保守的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)蛋白,该研究初步探索其在果蝇神经系统发育中的功能。[方法]合成tap基因的编码序列并亚克隆至p UAST质粒,通过胚胎显微注射和mini-white标记基因筛选,获得UAS-tap转基因果蝇。将该转基因品系分别与ap-GAL4和GMR-GAL4果蝇品系杂交,采用定量RT-PCR方法检测杂交前后tap基因表达水平,并在显微镜下观察杂交后代的发育情况。[结果]成功构建了p UAS-tap重组质粒,通过显微注射与转基因果蝇筛选、平衡及定位,共获得5个独立转基因品系。tap基因靶向表达后引起成虫出现糙眼,翅膀出现异位刚毛和异位翅脉表型。[结论]tap基因可能通过原神经模式,也可能通过调节神经前体细胞分化而参与神经发育。对该基因功能与调控的深入研究,将与脊椎动物中其同源基因ngn的同类研究互相借鉴。
  • 缺失pk-1影响AcMNPV启动子表达的分析
  • [目的]分析缺失pk-1对AcMNPV早期、晚期及极晚期基因表达的影响。[方法]将egfp基因片段分别插入到pFastBacDual载体上的p10和ph启动子下游,得到供体质粒pBac-Pp10-egfp和pBac-Pph-egfp。PCR扩增ie1、ie2、lef2、p6.9、vp39启动子片段,插入到pBac-egfp载体上的egfp基因上游,得到供体质粒pBac-Pie1-egfp、pBac-Pie2-egfp、pBac-Plef2-egfp、pBac-Pp6.9-egfp、pBac-Pvp39-egfp。将供体质粒分别转化含缺失pk-1基因的AcMNPV bacmid和Helper质粒的大肠杆菌DH10Bac中,得到一系列重组的AcMNPV bacmid。提取Bacmid DNA,转染Sf9细胞,转染120h后荧光显微镜下观察eGFP蛋白的表达。[结果]缺失pk-1后ie1、ie2、lef2、p6.9、vp39、p10、ph启动子均能启动下游egfp基因的表达。[结论]缺失pk-1不影响ie1、ie2、lef2、p6.9、vp39、p10、ph启动子启动的基因表达。
  • B交配型位点基因对杏鲍菇极性的鉴定
  • [目的]用B交配型位点基因对杏鲍菇不同极性菌株进行快速鉴定。[方法]根据杏鲍菇B交配型位点基因的信息素PEphb(3.3.1~3.3.4)和信息素受体PEPHSTE(3.3.1~3.3.4)基因设计8对特异性引物,对原生质体单核化得到的2个不同极性的杏鲍菇样本进行PCR扩增。[结果]4个信息素基因和3个信息素受体基因仅能在A2B2极性中存在,而在A1B1极性中不存在。[结论]用B交配型位点基因能对杏鲍菇不同极性进行鉴定,且这7个基因可以作为杏鲍菇原生质体单核化极性快速鉴定的SCAR分子标记。
  • 不同海拔血满草居群cpDNA psbA-trnH序列特征及其遗传结构
  • [目的]针对云南常用民族药血满草遗传背景研究少的现状,利用叶绿体DNA分析血满草遗传多样性和遗传背景。[方法]采集5个不同海拔分布的野生血满草居群,通过PCR技术扩增psb A-trn H序列并测序,然后利用生物学软件分析序列特征以及不同野生居群遗传多样性。[结果]血满草psbA-trn H序列长度范围在487~530 bp之间,GC含量为29.12~30.17%。Bioedit软件排列比对后长度为485 bp,其中有45个信息位点,包括1个单碱基缺失、15个点突变、29个同源信息位点。根据该序列,DnaSP软件分析表明血满草多样性(pi)为0.02004,平均变异数目为9.019,构成27个单倍型,单倍型多样性为0.997。其中居群1(海拔3 343 m)多样性最高,其次是居群3(海拔3 554m),再次是居群5(海拔3 790 m),最小的为居群2(海拔3 445 m)。居群间的遗传分化系数在0.~0.089之间,居群间的遗传距离在0.013~0.022之间。[结论]不同海拔血满草居群之间遗传分化不明显,远低于异交生物平均水平。另外,谱系分析也表明血满草不同居群之间的系统关系不清晰,与地理分布和海拔分布的关系不明显。该结果可能与血满草为克隆繁殖、高适应能力、种子传播范围广等生活史策略相关。同时也可能是psb A-trn H序列在居群水平上分辨率不够造成。
  • 绿脓杆菌外膜蛋白OprF的生物信息学分析
  • [目的]利用生物信息学方法预测绿脓杆菌外膜蛋白OprF的理化性质、高级结构和细胞表位。[方法]采用在线软件预测OprF蛋白的理化性质;Signal P 4.1软件预测OprF信号肽序列;利用TMHMM软件预测ACFA蛋白跨膜结构;SOPMA服务器预测蛋白的二级结构;Swiss-Model程序预测OprF三维结构;综合ABCpred与Bepi Pred方案预测OprF的B细胞表位;运用神经网络法预测OprF的CTL表位;使用MHC-Ⅱ类分子结合肽程序预测OprF的Th细胞表位。[结果]OprF为亲水性蛋白;1~24位氨基酸为信号肽序列;存在多个酶切位点;无跨膜结构并定位于细胞膜外;二级结构中含无规则卷曲34.36%、α-螺旋31.90%、β-转角11.66%、β-片层22.09%;并可能存在3个B细胞表位、2个CTL表位、4个Th细胞表位。[结论]系统分析了OprF蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构、二级与三级结构,以及B、T细胞抗原表位。
  • 贵州地方山羊品种H-FABP基因第3外显子SNP研究
  • [目的]研究3种贵州地方山羊品种H-FABP基因第3外显子的多态性以及进行该基因多态性生物信息学分析,以期筛选出适合的突变位点,研究其与山羊生长性状关联性影响。[方法]以3种贵州地方山羊品种为试验材料构建DNA池,结合直接测序技术筛选H-FABP基因SNPs,并利用在线软件分析H-FABP基因RNA二级结构及其蛋白二、三级结构。[结果]仅在黔北麻羊和贵州白山羊H-FABP基因第3外显子处分别筛选到T120A和G152C两个SNPs,其中exon3-T120A为导致编码氨基酸发生的Phe→Ile改变的错义突变,而exon3-G152C为苏氨酸(Thr)的同义突变。[结论]exon3-T120A位点影响黔北麻羊H-FABP基因RNA二级结构,最小自由能由-189.40 kcal/mol变为-190.00 kcal/mol,其蛋白二级结构无规则卷曲由49变为48,延伸链由36变为37,exon3-G152C位点仅影响贵州白山羊RNA二级结构,最小自由能变为-185.40 kcal/mol。
  • 人白细胞介素-36受体拮抗剂的二级结构及B细胞表位的预测
  • [目的]预测人白细胞介素-36受体拮抗剂(interleukin-36 receptor antagonist,IL-36Ra)蛋白的特性及其B细胞抗原表位。[方法]以人IL-36Ra基因序列为基础,应用Expasy工具中Prot Param程序分析人IL-36Ra蛋白的氨基酸组成、理化性质和二级结构;采用Prot Scale网络服务器预测亲水性和柔韧性;采用Emini和Kolaskar方案分析其可及性。结合其二级结构的特性,进一步预测IL-36Ra的B细胞抗原表位。[结果]人IL-36Ra的二级结构主要由无规则卷曲(44.52%)、β折叠(30.97%)、α-螺旋(18.06%)和β-转角(6.45%)组成。IL-36Ra蛋白肽链的36-37、72-79、91-96、103-110、126-130和134-138区段为B细胞表位区域的可能性较大。[结论]该研究采用多参数方案综合预测人IL-36Ra蛋白的二级结构和B细胞表位,为深入鉴定IL-36Ra的抗原表位及试验方法探索其单克隆抗体奠定了理论基础。
  • 中国海南野番茄上的一种新病毒-野番茄花叶病毒
  • [目的]鉴定引起海南水茄叶片呈典型皱缩和轻微花叶症状的病原物。[方法]对该病样提取总RNA,反转录成第一链c DNA,然后设计WTMV(Wild tomato mosaic virus)cp基因的特异引物,再利用常规PCR方法鉴定其病原是否为WTMV。[结果]通过PCR扩增获得一段约900 bp的DNA序列,包含WTMV全部CP(813 bp)蛋白基因编码区。分析表明该片段编码270个氨基酸,与WTMV-Laichua分离物核酸序列同源性为89%,氨基酸序列同源性为94%,且在所有的WTMV分离物中保守,可形成一个小的group。与其它马铃薯Y病毒属病毒的同源关系依次是PVMV、Chi VMV-Ⅰ、其它16个potyviruses(包括8个属于Chi VMV-Ⅱ的Chi VMV)。[结论]确定了引起海南水茄叶片皱缩和轻微花叶症状的病原物为野番茄花叶病毒(WTMV)。海南WTMV该分离物CP蛋白基因的Gen Bank登录号为KR781519。据我们所知,这是国内首次发现WTMV自然侵染水茄。
  • 线虫ASH神经元介导硫酸铜躲避行为依赖于TRPV通道OCR-2
  • [目的]研究秀丽线虫(Caenorhabdities elegans)ASH神经元介导硫酸铜躲避行为的分子机制。[方法]以硫酸铜为伤害性刺激物,考察其对TRPV通道基因ocr-2突变线虫的群体行为实验、个体行为实验、钙成像实验中的影响。[结果]ocr-2突变线对硫酸铜避指数降低了80%,在硫酸铜干滴刺激中后退位移仅为野生型的60%,并且其ASH神经元对硫酸铜刺激产生异常的约延时10 s的钙信号窄峰。[结论]OCR-2在线虫ASH神经元介导硫酸铜躲避行为中是必需的,能够介导硫酸铜刺激施加和撤除的钙信号峰的形成,同时还可能参与其他神经元与ASH神经元之间的抑制调控。
  • 芹菜素抑制α-葡萄糖苷酶的分子机制研究
  • [目的]分析芹菜素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型,并探讨其抑制的分子作用机制。[方法]采用Lineweaver-Burk双倒数方程,分析芹菜素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型;荧光光谱和分子对接阐述芹菜素抑制α-葡萄糖苷酶的分子作用机制。[结果]芹菜素对α-葡萄糖苷酶的抑制类型为竞争型抑制,抑制常数Ki=12.08μg/m L。芹菜素和α-葡萄糖苷酶的结合导致酶分子的内在荧光静态猝灭,不同温度(298 K、304 K、310 K)条件下荧光猝灭常数KA分别为0.859 4×10^4、0.617 7×10^4、0.486 5×10^4L/mol。酶分子中Tyr158、Ser240、Pro312、Phe314和Asn415等氨基酸残基为芹菜素与其结合的重要活性位点,芹菜素的A环5-OH和7-OH、B环4'-OH结构对其抑制活性起到关键作用。[结论]芹菜素是α-葡萄糖苷酶的竞争性抑制剂,疏水作用力和氢键是其与酶分子间的主要作用力。
  • CRM197修饰的肿瘤细胞裂解物疫苗抗肝癌作用研究
  • [目的]探讨CRM197能否增强H22肝癌细胞裂解物疫苗的抗肿瘤活性。[方法]反复冻融H22细胞制备裂解物,与CRM197偶联,制备H22-CRM197疫苗,以小鼠皮下移植瘤模型考察疫苗抗肿瘤活性,并对免疫学机制进行探讨。[结果]与PBS组相比,H22-CRM197免疫显著降低了荷瘤小鼠肿瘤重量(0.53±0.20 g VS 2.04±0.43 g,p〈0.01);与PBS组比较,H22-CRM197组小鼠免疫血清中检测到高滴度的抗-H22抗体(p〈0.01);H22-CRM197免疫能够有效地刺激脾淋巴细胞的增殖并诱导产生了明显靶向H22细胞的细胞毒性T淋巴细胞杀伤作用。[结论]CRM197可以显著增强H22肝癌细胞裂解物疫苗的抗肿瘤活性。
  • 抑制剂LY294002调控胞内布鲁氏菌的存活
  • [目的]检测PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002(LY)对巨噬细胞和小鼠体内羊种布鲁氏菌16M(16M)存活的影响。[方法]将抑制剂LY(20μmol/L)与细胞共同孵育1 h,并将其腹腔注射小鼠(20 mg/kg/day),然后16M感染巨噬细胞和小鼠,细菌菌落计数法计算细胞内和小鼠体内的细菌数量,MTT法检测抑制剂LY对细胞活性的影响,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抑制剂LY对TNF-α分泌的影响。[结果]抑制剂LY在20μmol/L浓度时不影响细胞活性,抑制剂LY显著抑制了布鲁氏菌在巨噬细胞和小鼠体内的存活(P〈0.05),抑制剂LY显著提高了布鲁氏菌介导的TNF-α水平(P〈0.01)。[结论]研究表明,PI3K/Akt信号通路抑制剂LY可调控巨噬细胞和小鼠体内羊种布鲁氏菌16M的存活,为布鲁氏菌致病机制提供科学依据。
  • 变温对破囊壶菌FJN-10脂肪酸组分和蛋白质组的影响
  • [目的]以破囊壶菌Thraustochytrium sp.FJN-10为研究对象,研究不同培养温度和变温条件对菌体生物量、油脂含量、脂肪酸组分、关键基因转录以及蛋白质组的影响。[方法]通过摇瓶实验测定干重研究菌株的生长,提取油脂并经液相色谱分析脂肪酸组分;荧光定量PCR和二维电泳研究脂肪酸合成途径关键的碳链延长酶、脱饱和酶的转录水平和蛋白质的差异表达。[结果]28℃培养时,生物量达13.6 g/L,DHA占总脂肪酸含量达32.41%;15℃培养时,生物量为9.8 g/L,DHA占总脂肪酸含量达56.08%。变温培养下生物量最高可达13.9 g/L、油脂含量及DHA含量在较高的水平。28℃降至15℃时,△4脱饱和酶和△6延长酶基因基因的转录分别提高了3.9和2.5倍。[结论]变温条件下菌株生物量在11.8~13.6 g/L,菌体稳定期延长,DHA的含量可达45%以上。可为今后DHA的产业化提供基础数据。
  • 生物硫铁生成菌的选育及处理重金属效果研究
  • [目的]分离高产生物硫铁生成菌,初步鉴定并研究其生成限制因素及处理重金属效果。[方法]利用分离驯化出的1株高产生物硫铁复合材料(生物硫铁)的硫酸盐还原菌(srb1),考察硫酸亚铁浓度、有机物浓度以及搅拌速度对其生成生物硫铁的影响。[结果]有机物和Fe SO4·7H2O的浓度是制约生物硫铁生成的关键因素,生物硫铁处理重金属Cr6+、Pb2+、Cd2+、Cu2+效果显著,去除率达90%以上,尤其是处理重金属Cu2+废水最佳,去除率达99%以上。[结论]筛选到生物硫铁生成菌srb1,初步鉴定为梭状芽胞杆菌属Clostridium mesophilum。确定了生物硫铁生成的最佳培养条件为乳酸钠15 m L/L+酵母膏8 g/L+Fe SO4·7H2O 15 g/L。
  • 疏水性物质外膜通道蛋白及应用研究进展
  • 疏水性物质外膜通道蛋白是G-细菌特有的摄取胞外疏水性物质的通道,与G-细菌降解疏水性有机污染物密切相关。该文对已发现的两类疏水性通道蛋白进行了综述,重点概括了这两类通道蛋白的结构、运输底物和机理以及它们的应用。另外还展望了类似通道蛋白的鉴定以及利用此类通道蛋白构建全细胞催化系统在环境修复中的应用。
  • 酵母细胞内离子稳态的调控机制
  • 活有机体都需要营养矿物质来维持生长,并形成了捕获、利用以及贮存营养矿物质的有效机制。过量的离子对细胞也可能是有毒性的,因此细胞形成了复杂的稳态调节机制来调节它们的胞内水平,以维持细胞的正常生长和避免过量的离子对细胞造成的毒性。该文综述了酿酒酵母细胞内p H的调控,细胞对金属离子的吸收、贮存和外排的机制,包括一价金属离子Na+和K+、二价阳离子Ca2+和Mg2+,以及微量金属离子Fe2+、Zn2+、Cu2+和Mn2+等。并提出有待研究的问题和措施,也对今后的研究趋势和研究意义进行了展望。
  • [论著]
    人PSCA和PAP融合基因真核表达质粒的构建与表达(于涧[1,2];王宇;朱晓明;武帅;王籽橙;姜云波;杜芝燕;阎瑾琦;于继云)
    人可溶性VEGFR2和IL-12融合基因真核表达质粒的构建与表达(杨克科;张明磊)
    线粒体自噬受体Bnip3的载体构建及蛋白表达纯化(张玲莉;张星亮)
    Carboxin抗性基因(Cbx^R)原核表达及多克隆抗体的制备(李小宇;张正坤;王秋华;张春雨;张淋淋;尤晴;杨凤升;王永志;李启云)
    tap基因靶向表达导致果蝇神经系统异常发育(刘洪超;胡澍;霍言言;丁劲峰;钟亚迪;涂心明)
    缺失pk-1影响AcMNPV启动子表达的分析(赵淑玲;戴雪娟;薛亚男;郝佳慧)
    [技术与方法]
    B交配型位点基因对杏鲍菇极性的鉴定(马康;刘宇[1,2];许峰[1,2];王守现[1,2];赵爽[1,2];荣成博[1,2])
    不同海拔血满草居群cpDNA psbA-trnH序列特征及其遗传结构(杨青松[1,2,3];熊勇[1,2,3];胡琳[1,2,3];赵艳;卢志敏;刘瑞)
    绿脓杆菌外膜蛋白OprF的生物信息学分析(刘祥)
    贵州地方山羊品种H-FABP基因第3外显子SNP研究(钱成;罗卫星;孙岩岩;黄兰;刘彬;蔡惠芬)
    人白细胞介素-36受体拮抗剂的二级结构及B细胞表位的预测(彭笑;潘秀和;袁仙丽;高巧艳;李燕;李明才)
    中国海南野番茄上的一种新病毒-野番茄花叶病毒(张真[1,2];章绍延;余乃通;王健华;龚殿;刘志昕)
    线虫ASH神经元介导硫酸铜躲避行为依赖于TRPV通道OCR-2(王薇;吴政星)
    [开发与应用]
    芹菜素抑制α-葡萄糖苷酶的分子机制研究(屠洁[1,2];陈钧;刘冠卉)
    CRM197修饰的肿瘤细胞裂解物疫苗抗肝癌作用研究(张艳丽;司春枫;张玉梅;赵慧琳;徐茂磊;李波清)
    抑制剂LY294002调控胞内布鲁氏菌的存活(印双红;张俊波;李默;罗静;李建新;冉辉;杨文才;陆安法;郭飞;陈创夫)
    变温对破囊壶菌FJN-10脂肪酸组分和蛋白质组的影响(周芬;张明亮;黄建忠;江贤章)
    生物硫铁生成菌的选育及处理重金属效果研究(杨阳[1,2];谢翼飞;朱德文;谷晋川;冯栩;魏春梅)
    [专题综述]
    疏水性物质外膜通道蛋白及应用研究进展(汪海基[1,2,3];陈杏娟[2,3];许玫英[2,3])
    酵母细胞内离子稳态的调控机制(赵运英;徐慧慧;张艳;蒋伶活)
    《生物技术》封面

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