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文献检索:
  • 嗜水气单胞菌溶血素基因克隆与序列分析
  • [目的]对嗜水气单胞菌溶血素基因(HlyA)进行克隆、序列分析和蛋白三级结构预测。[方法]根据嗜水气单胞菌溶血素基因(HlyA)设计特异性引物,采用PCR方法扩增并亚克隆至pMD18-T载体中,进行DNA测序分析。[结果]获得Hly A基因片段大小为1 022 bp,推导编码297个氨基酸,其中1-30aa区域为信号肽序列,7-196aa区域为溶血素-N端结构域(PF12563),222-297aa区域为杀白细胞素结构域(PF07968)。HlyA蛋白三级结构与模板(PDB:1XEZ_A)相似性达41.76%,主要由β折叠、转角构成,与拉马钱德兰图方法检测Hly A蛋白空间结构基本一致。[结论]该研究有助于理解嗜水气单胞菌Hly A基因功能及其溶血机制。
  • 大鼠PLCG2基因的pHBAd-MCMV-GFP真核表达载体构建及鉴定
  • [目的]构建大鼠PLCG2(rPLCG2)的pHBAd-MCMV-GFP真核重组质粒,为进一步构建rPLCG2高表达腺病毒载体奠定基础。[方法]以合成的rPLCG2-pUC57质粒为模板,PCR扩增获得r PLCG2基因,并克隆至真核表达载体pHBAd-MCMV-GFP中。转化DH5α感受态,菌液PCR阳性克隆鉴定,并对阳性样本进行测序。[结果]成功构建了真核重组质粒pHBAd-MCMV-GFP-rPLCG2。[结论]pHBAd-MCMV-GFP-rPLCG2真核表达载体的成功构建为后续rPLCG2高表达腺病毒载体的构建及其功能的研究奠定基础。
  • IL-37基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建
  • [目的]克隆白介素-37(IL-37)基因启动子,构建其荧光素酶报告基因载体,并分析活性。[方法]用PCR方法扩增IL-37基因5'端上游区3个不同长度的启动子片段,分别克隆入荧光素酶报告基因载体p GL3,构建IL-37基因启动子荧光素酶报告基因质粒。将所构建的质粒转染HEK-293细胞,通过双荧光素酶报告基因系统分析启动子的转录活性。[结果]754、1 017、2 043 bp等3个IL-37启动子片段正确亚克隆入荧光素酶报告基因载体,重组质粒转染HEK-293细胞后,双荧光素酶活性分析显示1 017 bp的启动子片段具有较强转录活性,约为对照组(空载体p GL3-basic)的10.9倍。[结论]成功克隆IL-37基因启动子,构建了大小为1 017 bp的IL-37基因启动子荧光素酶报告基因载体,为IL-37表达的调控机制的研究提供有效的工具。
  • 斑点叉尾鮰LEAP-2和NK-lysin抗菌肽在毕赤酵母中的串联表达
  • [目的]合成密码子优化的斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)LEAP-2与NK-lysin成熟肽的串联基因(LN),构建真核重组表达载体p PICZαA-LN,实现LN在毕赤酵母中的重组DNA表达并对其纯化。[方法]参考编码斑点叉尾鮰LEAP-2和NK-lysin成熟肽的c DNA序列,根据毕赤酵母(Pichia pastoris)的密码子偏爱性,优化合成LEAP-2与NK-lysin成熟肽的串联基因LN,两者之间通过α因子信号肽酶切位点对应的核苷酸序列连接;选择表达载体p PICZαA,构建重组表达载体p PICZαA-LN;电转化至毕赤酵母X-33,29℃、p H 6.0条件下,采用1.0%甲醇诱导表达目的蛋白;采用阳离子交换层析对表达产物进行分离纯化。[结果]Tricine-SDS-PAGE分析显示,培养72 h的表达产物经阳离子交换层析,获得了重组体LEAP-2成熟肽、NK-lysin成熟肽和两者的串连表达物;LEAP-2成熟肽的分泌表达效率较NK-lysin成熟肽的高。[结论]实验构建了斑点叉尾鮰LEAP-2与NK-lysin串联基因的真核重组表达载体,并在毕赤酵母X-33中成功表达。
  • 布鲁氏菌rirA基因的表达与功能分析
  • [目的]构建布鲁氏菌rirA基因的原核表达载体并进行表达、鉴定。[方法]将rirA基因克隆至pET-28a载体,构建重组质粒pET-28a-rirA,并转化至E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western blotting检测目的蛋白的表达及其反应原性,并对该蛋白进行生物信息学分析。[结果]PCR扩增出rir A基因全长为462 bp,编码153个氨基酸,SDS-PAGE分析表明获得了约19.8 k Da的融合蛋白,Western blotting结果显示该融合蛋白与羊抗布鲁氏菌阳性血清发生特异性反应,表明其具有良好的反应原性;生物信息学分析显示,该蛋白无跨膜区结构,不存在信号肽,二级结构以α-螺旋为主并利用Phyre2服务器成功构建了该蛋白的三维模型。[结论]成功构建了rirA基因的原核表达载体,所表达蛋白具有良好的反应原性。并且作为胞内蛋白参与布鲁氏菌铁代谢的转录调控。
  • 香港海鸥菌OsmC蛋白的原核表达、纯化及活性研究
  • [目的]原核表达纯化香港海鸥菌OsmC蛋白,并检测其抗氧化功能。[方法]通过PCR法扩增香港海鸥菌OsmC基因,将目的片段进行双酶切后连接到pET28a,构建重组质粒pET28a-OsmC并转化大肠杆菌,诱导OsmC蛋白表达,亲和层析纯化目的蛋白并利用氧化铁二甲酚橙实验检测其过氧化物酶活性。[结果]克隆得到全长基因,大小为441bp,编码147个氨基酸。得到重组表达质粒pET28a-OsmC,表达并纯化获得重组OsmC蛋白,OsmC蛋白能够降解H2O2。[结论]Osm C蛋白具有过氧化物酶活性,为研究香港海鸥菌的抗氧化机制奠定了基础。
  • 颈棱蛇蛇毒金属蛋白酶基因扩增及系统进化分析
  • [目的]扩增颈棱蛇蛇毒金属蛋白酶基因,并对其进行系统进化分析。[方法]通过PCR方法扩增颈棱蛇蛇毒金属蛋白酶基因,使用Lasergene Meg Align 8.1.3软件对多个蛇种的蛇毒金属蛋白酶序列进行比对,使用MEGA 6.06对颈棱蛇和其它蛇种的蛇毒金属蛋白酶氨基酸序列进行进化分析。[结果]颈棱蛇蛇毒金属蛋白酶编码区长1 854 bp,编码617个氨基酸残基。该酶的核酸序列与绿栖林蛇、银环蛇、舟山眼镜蛇、圆斑蝰蛇和尖吻蝮蛇的序列相似度分别为82.1%、79.2%、79.1%、75.2%和75.7%,氨基酸序列相似度分别为68.9%、63.3%、63.1%、60.3%和60.1%。进化分析显示,颈棱蛇和同属于游蛇科水游蛇亚科的波加丹游蛇亲缘关系最近,其次为游蛇科美洲钝头蛇亚科的绿栖林蛇,与眼镜蛇科和蝰科这两个科亲缘关系最远,与非洲蛇科的小鳞穴蝰亲缘关系介于游蛇科和眼镜蛇科之间。[结论]蛇毒金属蛋白酶可以作为蛇种进化分析的一种重要参考基因。
  • 全基因组预测希金斯炭疽菌的候选效应分子
  • [目的]希金斯炭疽菌可以侵染十字花科诸多植物引起炭疽病,给各国农业生产造成了巨大经济损失。对该菌候选效应分子进行预测,并对其特征进行明确。[方法]利用Signal P、Prot Comp等程序对该菌中分泌蛋白进行找寻,并对分泌蛋白所具有的氨基酸大小、信号肽长度以及理化性质等进行分析。结合已经报道的真菌效应分子具有的典型特征,明确该菌存在的候选效应分子数量及特征。[结果]希金斯炭疽菌含有658个分泌蛋白,氨基酸长度集中于50~300 aa之间;信号肽长度以17~21个aa的序列最为集中;信号肽切割位点属于A-X-A类型;分泌蛋白在分子量、等电点、不稳定系数等方面均存在差异,但大多数分泌蛋白属于亲水性蛋白。其中,预测功能的蛋白为290个,其功能较多的集中于酶类,包括脂肪酶、α-L-鼠李糖苷酶、果胶酯酶等。依据候选效应分子典型特征,明确该菌中含有388个候选效应分子。[结论]通过上述生物信息学分析方法,结合真菌效应分子典型特征,有效地实现了希金斯炭疽菌候选效应分子的预测,其信号肽切割位点类型与其他已经报道的致病疫霉、粗糙脉孢霉等分泌蛋白信号肽切割位点一致,分泌蛋白功能涉及较多的酶类,也与其他已经报道的病菌分泌蛋白功能相类似。
  • 人VASH_1蛋白结构和功能的生物信息学分析
  • [目的]对人VASH_1蛋白结构和功能进行生物信息学分析。[方法]利用生物信息学工具对人VASH_1蛋白的基因结构、跨膜区域、空间结构、理化性质和功能区进行预测。[结果]人VASH_1蛋白由365个氨基酸残基组成,该蛋白等电点9.50,相对分子质量40 956.5Da,分子式为C1805H2874N532O536S11。通过分析发现该蛋白为非跨膜的亲水蛋白,主要由无规卷曲构成。[结论]人VASH_1蛋白是由365个氨基酸残基组成的亲水蛋白,含有21个磷酸化位点和13个可能的抗原位点,与多种蛋白间存在相互作用。
  • 新疆蛙类遗传多样性与系统发育研究
  • [目的]为了解新疆地区中国林蛙中亚林蛙、中亚侧褶蛙和阿尔泰林蛙的遗传多样性及系统发育。[方法]分别于新疆7个地方采集了4种蛙类共53个个体,对线粒体12S RNA基因进行了扩增和测序。[结果]经过拼接和比对,得到长度为893 bp片段的序列,4种蛙类共定义了21个单倍型,其中,中国林蛙、中亚侧褶蛙和阿尔泰林蛙遗传变异程度高,而中亚林蛙的遗传变异很低。各群体总遗传分化系数Gst为0.367 88,总固定系数Fst为0.871 56,总基因流Nm为0.04。中国林蛙与中亚林蛙之间的遗传距离最大,为0.158,与中亚侧褶蛙之间的遗传距离次之,为0.137,与阿尔泰林蛙之间遗传距离最小,为0.034。聚类分析显示中国林蛙和阿尔泰林蛙聚为一支,中亚林蛙和中亚侧褶蛙聚为一支。[结论]新疆地区的中国林蛙、中亚侧褶蛙和阿尔泰林蛙的遗传多样性丰富,中亚林蛙的遗传多样性较低,各群体遗传分化程度较高。
  • 番茄根内生假单胞菌的分离与鉴定
  • [目的]通过对番茄根内生假单胞菌的分离和纯化,为研究番茄根内生假单胞菌生态学及其与植物生长之间的关系,筛选潜在的植物病害生防菌株奠定基础。[方法]以福州闽侯蔬菜大棚种植的番茄为研究对象,采用传统微生物培养技术分离纯化根内生细菌。通过16S rDNA序列同源比对与分析,鉴定和统计番茄根内生菌中可培养假单胞菌的种类和数量。[结果]在分离纯化得到的21株番茄根内生菌中,经分子鉴定其中12株为假单胞菌(Pseudomonas),序列对比和系统发育分析表明12株假单胞属可分为4个不同的类群。从统计结果来看,假单胞菌属占所培养的番茄根内生菌总数的52.1%。[结论]假单胞属细菌占番茄根可培养内生菌总数的52.1%,为优势菌,并具有较高的种类多样性。
  • β-淀粉样肽寡聚体的制备及鉴定
  • [目的]制备β-淀粉样肽(amyloid-βpeptide,Aβ)的可溶性寡聚体。[方法]选取化学合成的Aβ25-35、Aβ1-42及对照肽Aβ35-25,体外37℃孵育7 d制备Aβ寡聚体。采用dot blotting,免疫印迹鉴定Aβ的聚集状态;并通过TUNEL法检测Aβ的神经毒性。[结果]经dot blotting和免疫印迹检测,显示本研究制备获得的Aβ25-35和Aβ1-42均为寡聚体,且Aβ25-35寡聚体的分子量以2 kDa、3 kDa和17 kDa为主,Aβ1-42分子量主要为4kDa和8kDa,而对照肽Aβ35-25并不能形成寡聚体。TUNEL法则显示Aβ25-35寡聚体可以引起SH-SY5Y细胞凋亡。[结论]在体外成功建立制备Aβ寡聚体的方法,且通过形态学实验证实该Aβ有神经毒性,为后续研究阿尔兹海默症的致病机制奠定实验基础。
  • 镉胁迫对香鱼热休克转录因子1基因组织表达的影响
  • [目的]克隆香鱼热休克转录因子1(Heat shock transcription factor1,HSF1)基因,并探究镉胁迫对其表达的影响。[方法]利用3’RACE和5’RACE技术克隆香鱼HSF1基因c DNA全长,并进行序列分析,通过半定量PCR(RTPCR)检测HSF1在各组织中的表达情况,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测分析镉胁迫后HSF1表达量的变化。[结果]香鱼HSF1基因c DNA序列全长2 127 bp(不含poly A),含一个1 587bp、编码528个氨基酸的开放阅读框(ORF);预测其编码蛋白分子量为57.956 87 k Da,等电点为4.56。与虹鳟进化关系最近。反转录PCR(RT-PCR)显示香鱼HSF1基因在鳃中表达量最低、肌肉中次之,其余组织中基本一致。qRT-PCR结果显示镉胁迫后香鱼肝、心和肌肉中HSF1基因表达量均显著增加,脾、肾和鳃中表达量均显著减少。[结论]HSF1基因参与香鱼镉胁迫应激反应。
  • ABCC2在胆管细胞癌中的表达及其临床意义
  • [目的]探讨ABCC2在胆管细胞癌中的表达水平及其临床意义。[方法]收集湖北中医药大学附属医院病理科2010~2015年20例胆管细胞癌组织及其配对的10例远癌组织,利用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测两组ABCC2的表达,比较分析ABCC2表达水平与胆管细胞癌的临床分期以及淋巴结转移的关系。[结果]ABCC2基因或蛋白在胆管细胞癌组织和远癌组织中均有不同程度的表达,且在癌组织的表达量显著低于远癌组织(P〈0.05);此外,ABCC2表达在胆管细胞癌的不同淋巴结转移之间没有显著差异。[结论]ABCC2在胆管细胞癌中低表达(mRNA表达水平P=0.003,蛋白表达水平P=0.0031),且与淋巴结转移之间没有显著差异,可能在胆管细胞癌的发生发展中起一定作用,有助于胆管细胞癌的临床诊断和病情评估。
  • ova和HPV E_6及其蛋白滴鼻免疫增强小鼠抗体水平
  • [目的]探讨ova和HPV E_6及其蛋白通过滴鼻共免疫的方式提高抗体水平的有效性。[方法]选择ova和OVA蛋白,HPV E_6和HPV E_6蛋白滴鼻共免疫ICR小鼠,检测免疫后小鼠血清中的Ig G、Ig G1、Ig G2a和s Ig A,生殖道黏液中s Ig A的表达水平。[结果]ova及其蛋白共免疫组血清中的抗体Ig G及其亚类、血清和生殖道洗液中的s Ig A与对照组相比差异极显著(P〈0.01),初免后第28 d,血清中的Ig G抗体滴度达到28万。HPV E_6与其蛋白共免疫组血清中的抗体Ig G及其亚类、生殖道洗液中的s Ig A与对照组相比差异极显著(P〈0.01),初免后第35 d,血清中的Ig G抗体滴度达到25万。[结论]用ova和HPV E_6及其蛋白通过滴鼻共免疫,产生高水平抗体,共免疫组的抗体水平比基因疫苗组增强了近百倍,比蛋白免疫组增强了2.5倍,表明这种免疫方式能够有效激发黏膜免疫反应和系统免疫反应。
  • 诺考达唑和阿非科林对人胚胎干细胞周期的影响
  • [目的]探究诺考达唑和阿非科林联合应用对人胚胎干细胞周期同步化到G1和S期的作用并观察药物对细胞生长和生物功能的影响。[方法]采用诺考达唑和阿非科林先后作用于胚胎干细胞,流式细胞仪测定细胞周期,显微镜下观察药物对细胞生长状态的影响,荧光染色技术观察胚层标志物α-SMA和β-tubulin表达。[结果]加入诺考达唑和阿非科林后,G1期为66.35%,S期为33.52%,多数细胞被同步化在G1期;诺考达唑作用16 h,G1期为18.45%,S期为79.10%,多数细胞从周期抑制中恢复;能够形成典型的拟胚体;荧光染色显示α-SMA和β-tubulin均有表达。[结论]诺考达唑和阿非科林联合作用能够使胚胎干细胞66.35%同步化在G1期,诺考达唑作用16 h,79.10%的细胞同步化在S期。中胚层标志物α-平滑肌肌动蛋白和外胚层标志物β微管蛋白在蛋白水平均有明显表达。去除药物后,细胞未发生显著性损伤。
  • 深海细菌Pseudomonas sp.IOFA1醇脱氢酶酶学性质研究
  • [目的]对来自印度洋深海的一株假单胞菌醇脱氢酶(Adh)进行序列分析和酶活性质分析。[方法]首先以同源比对和进化树聚类为手段分析该酶序列信息。其次,在E.coli宿主中进行重组表达和镍柱亲和纯化后,对重组醇脱氢酶的酶活性质进行进一步地研究。[结果]结果显示Adh蛋白与其它物种已知醇脱氢酶的氨基酸序列最高相似性为81%,分属于第三类醇脱氢酶蛋白。酶学性质分析表明,重组酶Adh的最适作用温度为42℃,表现出良好的中低温适应性;最适pH值为5.0,在pH4—6时具有较高的活性,表明Adh为酸性醇脱氢酶。Zn^2+、Na^+在终浓度为0.5mmol/L时对Adh有明显的激活作用,尤其是Zn^2+可使Adh的酶活显著提高11%。[结论]实现了adh基因在大肠杆菌的高效表达,为Adh的应用提供了理论依据。
  • 芒草木质素含量对里氏木霉产木质纤维素酶的影响
  • [目的]研究芒草木质素含量对里氏木霉产木质纤维素酶的影响。[方法]选择了2组木质素含量差异显著(p〈0.01,n=3)、纤维素和半纤维素含量相近的芒草材料作底物来培养3株里氏木霉(野生型QM6a、突变型QM9414和RutC30),对诱导产生的木质纤维素酶的酶活和降解木质纤维素的效率进行分析。[结果]在第1组中,Mfl40木质素含量比Msa02低36%(P〈0.01,/Z=3),其诱导3株菌生产的木质纤维素酶体积比酶活高于Msa02组1.2~1.8倍(P〈0.05或者P〈0.01,n=3);在第Ⅱ组中,Mfl37木质素含量比Mlu13低48%(P〈0.01,n=3),其生产的木质纤维素酶体积比酶活高于Mlu13材料1.2—3.3倍(p〈0.05或者P〈0.01,n=3)。[结论]芒草细胞壁中木质素含量对里氏木霉产木质纤维素酶量有显著负影响。
  • [论著]
    嗜水气单胞菌溶血素基因克隆与序列分析(胡秀彩;吕爱军[1,2];孙敬锋;陈成勋;李莉;孔祥会)
    大鼠PLCG2基因的pHBAd-MCMV-GFP真核表达载体构建及鉴定(陈晓光;吕琼霞;王静;周秀清)
    IL-37基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建(朱建冬;梁庄严;王森;侯为烨;邓小红;陈章权[1,2])
    斑点叉尾鮰LEAP-2和NK-lysin抗菌肽在毕赤酵母中的串联表达(宋长丰;李雯;陶妍)
    布鲁氏菌rirA基因的表达与功能分析(江雅丽;王震;李爽;王勇;李天森;郭飞;张辉;陈创夫)
    香港海鸥菌OsmC蛋白的原核表达、纯化及活性研究(黄海[1,2];游晓星;李冉辉)
    [技术与方法]
    颈棱蛇蛇毒金属蛋白酶基因扩增及系统进化分析(张志晓;崔庆华;田靖;郑颖;范泉水)
    全基因组预测希金斯炭疽菌的候选效应分子(韩长志)
    人VASH_1蛋白结构和功能的生物信息学分析(赵小峰)
    新疆蛙类遗传多样性与系统发育研究(叶小芳;袁亮;吕雪峰;何立志;王秀玲;季荣)
    番茄根内生假单胞菌的分离与鉴定(马荣琴;曹毅;周俊雄;叶朝松;张媞;陈明波;马绍城;田宝玉)
    β-淀粉样肽寡聚体的制备及鉴定(徐岩;侯筱宇)
    [开发与应用]
    镉胁迫对香鱼热休克转录因子1基因组织表达的影响(李笑萌;苗亮;李明云;徐玉敏;穆方申;陈炯)
    ABCC2在胆管细胞癌中的表达及其临床意义(袁博;黄艳)
    ova和HPV E_6及其蛋白滴鼻免疫增强小鼠抗体水平(王丹阳;杨雨;杨秀梅;张富春;张爱莲)
    诺考达唑和阿非科林对人胚胎干细胞周期的影响(魏建峰;王昱博)
    深海细菌Pseudomonas sp.IOFA1醇脱氢酶酶学性质研究(杨敏[1,2];陈兴麟[2,3];周治东;金敏[2,3];曾润颖[2,3])
    芒草木质素含量对里氏木霉产木质纤维素酶的影响(康永波[1,3];李傲[1,3];裴岩杰[1,3];涂媛苑[1,3];周诗光[1,3];魏小洋[1,3];李庆[1,2,4];郝勃[1,2,5];夏涛[1,2,5];彭良才[1,3])
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