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文献检索:
  • 黄粉甲肌动蛋白解聚因子基因的克隆及表达分析
  • [目的]克隆黄粉甲Tenebrio molitor肌动蛋白解聚因子基因,研究该基因在黄粉甲不同组织、不同发育阶段及被管氏肿腿蜂Scleroderma guani寄生后的表达情况。[方法]采用RACE技术、克隆该基因、实时荧光定量PCR检测其表达情况。[结果]该基因全长758 bp,分子量为16.96 kDa,无信号肽,与赤拟谷盗Tribolium castaneum肌动蛋白解聚因子的相似性达97%。荧光定量PCR分析表明,该基因在黄粉甲各发育阶段均有表达,成虫中表达量最高,在脂肪体中的表达量高于血细胞。被管氏肿腿蜂寄生6 h后,肌动蛋白解聚因子基因在寄生与未寄生黄粉甲蛹内的相对表达量无差异;寄生12 h后,该基因在寄生蛹中的表达量降低了1.96倍;寄生24 h和48 h后,该基因在寄生蛹中的表达量分别升高3.16倍和5.6倍。[结论]管氏肿腿蜂寄生能影响黄粉甲肌动蛋白解聚因子基因的转录水平。
  • SD大鼠维生素D受体真核过表达载体构建及功能分析
  • [目的]构建SD大鼠维生素D受体真核过表达载体并将其在癌细胞中表达及分析不同癌细胞VDR表达的差异性。[方法]通过基因工程方法从p UC18-rat-VDR质粒载体上通过PCR扩增得到了大鼠VDR片段全长,并构建CD513-VDR-EGFP真核超表达载体;经常规PCR、XbaⅠ和BamHⅠ双酶切及测序鉴定后提取重组质粒CD513-VDR-EGFP并进行细胞转染。利用Western Blot和qPCR方法分析蛋白和基因表达差异。[结果]荧光显微镜下可见单独转染CD513-EGFP和单独转染CD513-VDR-EGFP的293T细胞和HeLa细胞表达强烈的绿色荧光蛋白,并检测到蛋白及基因表达差异性的存在。[结论]成功构建重组质粒CD513-VDR-EGFP并在目的细胞中过表达(P〈0.01),本底水平表达的VDR在He La细胞中的表达略高于293T细胞(P〉0.05)。
  • 大鼠STIM1基因真核表达载体构建及蛋白表达定位
  • [目的]构建大鼠STIM1基因重组质粒并在A7r5细胞中表达、定位。[方法]应用基因合成方法获得STIM1基因序列,克隆至携带EGFP标签的真核表达载体p EGFP-C_1、p IRES_2-EGFP,经菌落PCR、酶切、测序鉴定后,转染至A7r5细胞,Western Blot检测蛋白表达,激光共聚焦观察其定位。[结果]STIM1全长2 058 bp,重组载体经酶切、PCR、测序鉴定构建正确,在A7r5细胞内高表达,并主要定位于细胞质。[结论]构建大鼠STIM1基因重组质粒并在A7r5细胞质中表达,为建立稳定高表达细胞系及后续功能研究奠定基础。
  • 小鼠resistin基因慢病毒表达载体构建及在KMB17细胞中的表达
  • [目的]构建携带小鼠resistin基因的慢病毒表达载体,并高效转导靶细胞。[方法]从小鼠脂肪组织提取总RNA,经PCR扩增、酶切、连接、转化后构建重组质粒;通过293T细胞包装为重组慢病毒颗粒,然后感染KMB17细胞,检测小鼠resistin基因在靶细胞中的表达。[结果]PCR扩增到预期的342 bp大小的resistin基因目的片段;构建的重组质粒经酶切得到了342 bp大小的目的片段,测序鉴定为小鼠resistin基因序列;重组慢病毒包装可观察到很强的绿色荧光,说明具有较高的质粒转染效率;重组慢病毒感染KMB17后可检测到小鼠resistin基因转录水平和蛋白水平的表达,证明resistin基因得到有效转导并可在靶细胞中高水平表达。[结论]成功构建了携带小鼠resistin基因的慢病毒表达载体并可在KMB17靶细胞中获得高效表达。
  • 米曲霉中蓝藻抗病毒蛋白-N基因的克隆与表达
  • [目的]提高蓝藻抗病毒蛋白-N(CVN)的异源表达量,获得大量高纯度可溶性蛋白。[方法]采用RT-PCR从酱油发酵酱醪宏基因组中克隆获得CVN基因cvn-SF,构建了重组表达载体p ET32a-cvn-SF,转化E.coli BL21菌株,获得工程菌株,优化表达条件,通过Ni-NTA凝胶亲和层析对CVN-SF蛋白进行纯化。[结果]工程菌株在温度30℃、添加1 mmol/L的IPTG诱导剂、培养时间12 h的条件下获得最高表达量的可溶性蛋白。Ni-NTA凝胶亲和层析纯化得到了230.8 mg/L的CVN蛋白,占提取总蛋白含量的33.37%。[结论]所得CVN蛋白高于目前报道的CVN在大肠杆菌的最高表达量140 mg/L^([11])。
  • 解淀粉芽孢杆菌TF28抗菌蛋白基因TasA克隆与表达
  • [目的]克隆解淀粉芽孢杆菌TF28抗菌蛋白基因Tas A并进行原核表达和抑菌活性研究。[方法]采用PCR方法扩增抗菌蛋白基因Tas A,连接p ET22b载体,导入E.coliBL21(DE3)菌株,进行IPTG低温诱导表达,用His柱纯化表达产物,采用纸片方法测定其抑菌活性。[结果]从解淀粉芽孢杆菌TF28中克隆了抗菌蛋白基因TasA,以pET22b为表达载体构建高效表达抗菌蛋白Tas A的基因工程菌株,该菌株在0.05 mmol/LIPTG 15℃诱导4 h,TasA蛋白表达率为34.2%,经His柱纯化后获得SDS-PAGE电泳一条带的纯化TasA蛋白,其含量为67.8 mg/L,收率为90.8%。该蛋白抑制番茄灰霉病和叶霉病、玉米茎基腐病和水稻稻曲病菌生长。[结论]实现抗菌蛋白基因Tas A的原核表达,表达率34.2%,表达蛋白具有广谱抑菌活性,在植病生防方面具有应用潜力。
  • 在豌豆植物中瞬时表达大鼠神经营养因子BDNF
  • [目的]克隆大鼠神经营养因子BDNF基因,构建植物表达载体,在豌豆植物中表达BDNF蛋白。[方法]采用RT-PCR法克隆大鼠脑源性神经营养因子BDNF基因,构建豌豆植物表达载体p CAPE2-BDNF,利用豌豆发芽种子真空侵染法在豌豆植物中瞬时表达BDNF蛋白,以His标签抗体进行Western Blot检测目的蛋白。[结果]获得含有鼠源性神经营养因子BDNF基因的植物表达载体p CAPE2-BDNF,His标签抗体检测到目的条带。[结论]BDNF蛋白在豌豆植物中成功表达,有助于进一步对其功能活性进行分析。
  • 人白介素-38原核表达载体的构建及其蛋白表达、纯化
  • $目的%构建人白介素(interleukin,IL)-38原核表达载体,原核表达IL-38重组蛋白、纯化及活性分析。[方法]PCR扩增IL-38成熟蛋白编码区,构建IL-38原核表达载体p ET-44-h IL-38,转化BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导,表达IL-38重组蛋白,并利用其C末端的组氨酸标签进行镍离子亲和层析纯化,将纯化的重组IL-38作用于脂多糖(LPS)诱导的THP-1细胞,研究纯化IL-38蛋白的生物学活性。[结果]构建的IL-38原核表达载体测序结果与Gen Bank中基因序列一致;IPTG诱导产生的IL-38蛋白主要以可溶性形式存在,纯化的目的蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分析和Western Blot鉴定发现,蛋白纯度可达98%,细胞实验证明纯化的目的蛋白具有较高的生物学活性。[结论]成功构建了IL-38的原核表达载体,制备了具有生物活性的IL-38重组蛋白。
  • 人β-淀粉样肽Aβ_(42)的融合表达与纯化
  • [目的]建立一种快速可靠、获取足量和高纯度的人β-淀粉样肽(Aβ_(42))的方法。[方法]首先利用重叠PCR技术扩增获得Aβ_(42)基因全长。随后将基因连入p GEX-4T-1载体,利用GST系统表达融合蛋白。分别在16℃、25℃、30℃和37℃诱导表达,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达情况,确定表达的最佳温度。根据优化条件进行目的蛋白的大量表达,利用Gstrap FF柱亲和纯化GST-Aβ_(42)融合蛋白。[结果]成功构建p GEX/Aβ_(42)表达载体,确定30℃为诱导表达的最佳温度。大量表达并经过纯化可获得分子量为30.7 k Da的融合蛋白。[结论]利用GST融合系统表达纯化可得到纯度超过90%的GST-Aβ_(42)融合蛋白,重组蛋白的产率约为1.2 mg/L培养基。当用凝血酶切除GST融合标签后,Aβ_(42)易聚集沉淀。
  • 牛病毒性腹泻病毒E2抗原表位表达及验证
  • [目的]获得高效表达的重组牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea virus,BVDV)E2免疫抗原蛋白。[方法]应用软件分析BVDV-E2蛋白抗原表位,将富含抗原表位基因片段连接表达载体p GEX-4T-1,并转化至大肠杆菌(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot检测诱导表达蛋白,经镍柱分离纯化;以纯化蛋白为包被抗原,用间接ELISA检测抗原对免疫血清的反应性。[结果]成功克隆BVDV-E2抗原表位基因,并在大肠杆菌中高效表达,Western Blot和ELISA证实表达重组蛋白对BVDV阳性血清具有反应原性。[结论]获得大小为49.5 k Da的BVDV-E2抗原表位蛋白,并且该抗原稀释度在1:40,抗体稀释度在1:20时结合效果最佳。可用于后续的纳米抗体筛选的研究。
  • 一个植物乳杆菌隐蔽质粒的序列分析
  • [目的]分离植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum LP101)中的质粒,并对其序列进行分析。[方法]从植物乳杆菌LP101中提取质粒并行双酶切,纯化后与载体pet22b进行连接,电转化到大肠杆菌DH5α中。将测序后得到的质粒片段进行拼接,对拼接成功的质粒进行序列分析。[结果]从植物乳杆菌LP101中分离得到一个隐蔽质粒p LP101,测序结果显示该质粒大小为3 496 bp,碱基G+C含量为38.2%,编码了一个移动蛋白和一个复制蛋白。BLAST结果显示该质粒的核苷酸序列与干酪乳杆菌(L.casei)中的质粒p SMA23相似性在99%以上。[结论]分离得到了植物乳杆菌LP101中的一个隐蔽质粒p LP101,推定其复制方式为滾环复制,属于滚环复制p C194家族成员。
  • 人参皂苷合成关键元件HMGR基因生物信息学分析
  • [目的]对人参皂苷生物合成途径关键元件HMGR基因进行生物信息学分析。[方法]采用生物信息学方法对人参HMGR基因编码蛋白的理化性质、结构、功能及亲缘关系进行系统分析。[结果]Pg HMGR基因序列有53个限制性酶切位点,编码573个氨基酸残基,蛋白亲水性趋势较平稳,疏水性较差;三维结构与人类其中的一个HMGR基因编码的蛋白具有54.92%的相似空间结构;推测HMGR基因可能在生物学、细胞及分子功能方面发挥重要作用;与三七HMGR基因序列同源性最高,相似性达92.49%。[结论]通过对HMGR基因功能及蛋白结构预测,明确了HMGR基因与人参皂苷生物合成密切相关,为人参皂苷HMGR基因的生物学功能研究奠定基础。
  • 水稻OsUVR8基因电子克隆及生物信息学分析
  • [目的]获得水稻Os UVR8基因的编码区序列,并进行生物信息学分析。[方法]以拟南芥UVR8蛋白的氨基酸序列作为查询探针,用电子克隆的方法获得Os UVR8基因的编码区序列;用生物信息学软件对Os UVR8蛋白进行预测和分析。[结果]Os UVR8基因有13个外显子,编码区序列长1 764 bp,编码587个氨基酸。Os UVR8蛋白分子量为62132.7 Da,理论等电点为5.87,含有41个芳香族氨基酸,比较稳定,为亲水性蛋白。无规则卷曲是主要的二级结构,其次是延伸链。位于细胞内叶绿体、线粒体之外的区域。具有9个RCC1重复。有35个磷酸化位点,19个O-β-葡萄糖糖基化位点,6个Yin-Yang位点。三级结构与拟南芥UVR8蛋白三级结构相似。[结论]获得了水稻Os UVR8基因的编码区序列并进行了生物信息学分析。
  • 嵌合基因CG32318及其蛋白的生物信息学分析
  • [目的]对黑腹果蝇嵌合基因CG32318及其蛋白的结构和功能进行生物信息学分析和预测。[方法]根据GenBank数据库中CG32318嵌合基因的mRNA序列,分别从开放阅读框、蛋白质理化性质、二级结构、信号肽、保守结构域、三维结构及蛋白质互作网络等方面分析。[结果]果蝇CG32318基因编码164个氨基酸,蛋白理论分子量为18.7k Da,理论等电点为8.90。CG32318蛋白属于不稳定性亲水性蛋白,二级结构主要包括无规卷曲(44.51%)和β-折叠(30.49%)。CG32318蛋白无信号肽和跨膜区,具有一个驱动蛋白马达和催化结构域。CG32318蛋白与Psf2、Sld5、Pole2等蛋白存在相互作用。[结论]果蝇CG32318蛋白可能具有微管结合和三磷酸腺苷ATP结合活性,参与以微管为轨道的运动过程。
  • 猪链球菌Lmb、Sao、ZnuA蛋白的抗原表位、二级结构分析及重组表位疫苗分子的设计
  • [目的]利用生物信息学方法设计猪链球菌候选疫苗蛋白Lmb、Sao、Znu A的重组表位多肽分子。[方法]通过ABCpred和Bepi Pred方案,预测猪链球菌Lmb、Sao、Znu A蛋白的B细胞表位。运用神经网络与量化矩阵法预测蛋白的CTL表位。使用MHC-Ⅱ类分子结合肽预测蛋白的Th表位。采用DNASTAR软件与SOPMA服务器预测蛋白二级结构,进而验证获得的B/T细胞表位的准确性。通过DNASTAR Protean软件重组拼接获得的B/T细胞抗原表位,设计抗原性较好的猪链球菌重组表位多肽。[结果]猪链球菌Lmb、Sao、Znu A蛋白的优势B细胞表位数分别为4个、4个和3个;CTL表位数各为1个;Th表位数分别为2个、1个和1个。二级结构预测显示这些表位大多处于蛋白易于产生表位的暴露表面、无规则卷曲与转角等位置。并设计获得抗原性较好的重组表位多肽。[结论]设计了抗原性较好的猪链球菌Lmb、Sao、Znu A蛋白的重组表位多肽。
  • FGF21对糖尿病Beagle犬降糖作用的研究
  • [目的]探讨成纤维细胞生长因子-21(FGF21)对糖尿病Beagle犬的降糖作用。[方法]通过注射四氧嘧啶(ALX)50 mg/kg和链脲霉素(STZ)30 mg/kg溶液,建立糖尿病Beagle犬动物模型。糖尿病模型复制成功后,考察25μg/kg、50μg/kg和100μg/kg的FGF21以及阳性对照50μg/kg的地特胰岛素注射液(Det),每72 h给药1次,连续给药10次后,对糖尿病Beagle犬血糖等生化指标和肝脏、胰腺组织切片的影响。[结果]与模型组相比,FGF21各剂量给药组Beagle犬体重呈现升高趋势(p〈0.05),各给药组血糖、糖化血红蛋白水平均显著降低,并呈剂量依赖性,即随着FGF21给药剂量的增加,治疗效果更明显,其中高剂量组治疗效果最佳,治疗后空腹血糖达到8.77±5.74 mmol/L,糖化血红蛋白浓度4.89±1.36%,C肽浓度为0.010±0.000 nmol/L,与模型组存在显著差异(p〈0.01、p〈0.05、p〈0.01)。FGF21各剂量组肝脏和胰腺组织病变程度明显减轻。[结论]FGF21对Beagle犬有明显的降低血糖作用,FGF21各剂量组肝脏和胰腺组织病变程度明显减轻,为糖尿病治疗提供了新思路。
  • 石油污染对土壤细菌结构特征的影响
  • [目的]探究准东油田地区石油污染对土壤细菌结构特征的影响。[方法]提取准东油田的背景土和油污土中的细菌DNA并进行PCR扩增,利用Miseq平台对其16S r DNA进行测序统计。[结果]总共得到93 033个细菌16S rRNA有效序列,划分为371个OTU单元;样品中优势菌群是放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)及变形菌门(Proteobacteria),厚壁菌门在背景样本中总数为29 732个,污染样本中为8 097个,数量剧减;变形菌门和放线菌门在石油污染土样中数目分别增长70%和47%;污染样品中多样性shannon指数平均为3.77,高于背景样品的2.77。[结论]证明了石油污染物对环境中的细菌结构影响显著,石油污染土壤中细菌结构多样性高于背景土壤,环境中能降解利用石油烃的菌种可能属于放线菌门和变形菌门。
  • 活性多肽序列结构分析鉴定技术的研究进展
  • 为了较全面地掌握多肽序列测定技术相关研究的最新发展,调研了近年来活性多肽序列分析、鉴定的相关文献,从经典的N端序列测定、质谱法机理研究、质谱法与软电离技术联用、核磁共振法等方面,对多肽序列测定技术的最新进展进行了综述,着重阐述4种软电离技术与质谱法的结合及应用。
  • [论著]
    黄粉甲肌动蛋白解聚因子基因的克隆及表达分析(李丽芳;赵满;黄镜梅;Elena N.Elpidina;朱家颖)
    SD大鼠维生素D受体真核过表达载体构建及功能分析(杨祎琦;程佳)
    大鼠STIM1基因真核表达载体构建及蛋白表达定位(庞春秀;林德馨)
    小鼠resistin基因慢病毒表达载体构建及在KMB17细胞中的表达(陈瑜;赵远;岳俊;李鸿钧;和占龙;马开利;马进;吴正存;唐东红;鲁帅尧)
    米曲霉中蓝藻抗病毒蛋白-N基因的克隆与表达(谢露[1,2];付显令[1,2];孙萍[1,2];林俊芳[1,2];郭丽琼[1,2];云帆;黎倩怡[1,2])
    解淀粉芽孢杆菌TF28抗菌蛋白基因TasA克隆与表达(张淑梅[1,2];姜威[1,2];孟利强[1,2];刘宇帅[1,2];曹旭[1,2];胡基华[1,2];李晶[1,2];高娃[1,2])
    在豌豆植物中瞬时表达大鼠神经营养因子BDNF(范亚军;郑梅竹;倪秀珍)
    人白介素-38原核表达载体的构建及其蛋白表达、纯化(周密;袁仙丽;潘秀和;李燕;李明才)
    人β-淀粉样肽Aβ_(42)的融合表达与纯化(吴骏;陈庆梅;王利娟)
    牛病毒性腹泻病毒E2抗原表位表达及验证(黄美玲;吴鹏;李天森;张国奇;杨霞;陈创夫;盛金良)
    [技术与方法]
    一个植物乳杆菌隐蔽质粒的序列分析(王海娟;戴雨珂;苏森森;潘渠)
    人参皂苷合成关键元件HMGR基因生物信息学分析(徐晓腾;李翔宇;林彦萍;尹锐;王康宇;孙春玉;张美萍;王义)
    水稻OsUVR8基因电子克隆及生物信息学分析(鲍思元)
    嵌合基因CG32318及其蛋白的生物信息学分析(丁劲峰;高香亭;宋祥和)
    [开发与应用]
    猪链球菌Lmb、Sao、ZnuA蛋白的抗原表位、二级结构分析及重组表位疫苗分子的设计(刘祥)
    FGF21对糖尿病Beagle犬降糖作用的研究(许会静;刘磊;董媛;朱文赫;王会岩)
    石油污染对土壤细菌结构特征的影响(谭银萍[1,2];马媛[1,2];吕杰[1,2])
    [专题综述]
    活性多肽序列结构分析鉴定技术的研究进展(高威芳;何魁芳;朱鹏;严小军)
    《生物技术》封面

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