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  • 罗非鱼补体C3基因的克隆及其表达分析
  • [目的]获得罗非鱼补体C3并了解其在罗非鱼免疫前后各组织中的表达特征。[方法]通过PCR扩增获得补体C3片段,通过DNA Star、MEGA 6.06等分析其序列及理化特性;将经纯化获得的Scp B蛋白以5μg/g的剂量免疫罗非鱼,利用实时荧光定量PCR测定C3在各组鱼体的表达变化。[结果]补体C3基因c DNA序列6 994 bp,ORF全长5 361 bp,共编码1 786个氨基酸。其在罗非鱼肝脏中表达量最高,且免疫组肝脏中C3表达量在感染后4h时显著高于对照组(p〈0.05);此外,感染前(0 h)免疫组头肾和脾脏中C3表达量均显著低于对照组(p〈0.05),但在感染后4~12h,免疫组表达量均呈升高趋势,而对照组则呈降低趋势。[结论]抗原免疫可提高罗非鱼感染无乳链球菌后组织中补体C3的表达量,补体C3在罗非鱼抵御无乳链球菌感染过程中发挥重要作用。
  • 水稻线粒体延伸因子OsEF-Tu基因的克隆及表达
  • [目的]克隆水稻线粒体基因Os EF-Tu并进行表达。[方法]RT-PCR分别扩增Os EF-Tu基因c DNA的5’端和3’端序列,重叠PCR克隆Os EF-Tu的c DNA序列。生物信息学分析Os EF-Tu基因,构建水稻线粒体基因Os EF-Tu原核表达载体并转化BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白。[结果]Os EF-Tu蛋白与多个高等植物线粒体延长因子EF-Tu蛋白具有同源性,p GEX-4T1-Os EF-Tu重组子构建成功并表达出带有GST标签的Os EF-Tu融合蛋白。[结论]水稻Os EF-Tu在高等植物中较为保守,原核表达Os EF-Tu融合蛋白在28℃诱导条件下包涵体中表达量高。
  • 肺炎支原体铁吸收调节蛋白基因的克隆表达与纯化
  • [目的]克隆肺炎支原体铁吸收调节蛋白(Fur)基因并纯化Fur蛋白,为研究其生物学功能奠定基础。[方法]利用Clustal Omega分析肺炎支原体Fur蛋白及其同源序列并用MEGA6.0构建进化树,通过PCR扩增Fur基因并对其进行双酶切,然后连接到p ET28a,得到重组载体p ET28a-Fur,将其转化大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导Fur蛋白表达,并通过亲和层析纯化Fur蛋白。[结果]多序列比对和进化树分析表明Mp含有一个Fur蛋白。克隆得到大小为477 bp的Fur基因,编码159个氨基酸。得到重组表达质粒p ET28a-Fur,该质粒能在大肠杆菌中能高效表达,并纯化得到重组Fur蛋白。[结论]成功克隆获得Mp Fur基因,在大肠杆菌中高效表达并获得高纯度Fur蛋白。
  • 马铃薯叶特异性启动子驱动的hIL-12在转基因马铃薯中表达
  • [目的]检测人白细胞介素-12(h IL-12)蛋白在转基因马铃薯叶片中的表达量、遗传稳定性以及组织特异性。[方法]利用RT-PCR检测基因马铃薯叶片中h IL-12基因在RNA水平的表达;利用Western Blot和ELISA检测转基因马铃薯叶片与块茎中h IL-12在蛋白水平的表达。[结果]在7个转基因马铃薯株系的叶片中检测到了h IL-12的表达,而在相应的块茎组织中未检测到明显表达。在经过2代无性繁殖后,外源蛋白的表达量稳定。[结论]获得了稳定表达h IL-12蛋白的转基因马铃薯植株,表达量最高达到2.84μg/g总蛋白。
  • 大肠杆菌γfiF基因原核表达系统构建、表达条件优化及蛋白纯化
  • [目的]构建大肠杆菌功能未知基因妒F的原核表达系统,对诱导表达条件进行优化,并纯化表达的可溶性YfiF融合蛋白。[方法]使用pETl6b表达质粒构建pET16b-yfiF原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达YfiF融合蛋白,对IPTG加入时机、终浓度及诱导时间进行优化,并使用镍柱纯化裂菌上清液中的可溶性Y矗F融合蛋白。[结果]构建了pET16b-yfiF重组质粒,IPTG诱导表达YfiF融合蛋白,最佳诱导条件为细菌生长至0D。值为1时加入IPTG。终浓度为0.1mmol/L,诱导9h。裂菌上清液中的可溶性YfiF融合蛋白纯化后浓度为209wg/ml。[结论]成功构建了妒F的原核表达系统,优化了诱导表达条件,可溶性YfiF融合蛋白得到纯化。
  • 人TNFα和AP融合基因的表达、纯化及功能鉴定
  • [目的]构建和表达人碱性磷酸酶(AP)与肿瘤坏死因子(TNFα)融合基因的真核表达蛋白。[方法]将TNFα基因克隆到真核表达载体p AP-tag2,转染到CHO细胞表达。通过AP亲和层析方法得到高纯度的AP-TNFα蛋白,利用配体-受体结合原理以及Octet系统检测其生物活性,免疫组化原理检测TNFα受体的分布。[结果]APTNFα重组质粒成功构建并表达,并得到高纯度的目的蛋白,测出它与其受体TNF-R2的亲和性,同时检测出TNFα受体在患者表皮组织的分布。[结论]p AP-TNFα质粒成功构建和表达,重组蛋白AP-TNFα与受体的亲和性常数为3.14×10-10M,同时发现自身免疫疾病患者TNFα受体表达过高。
  • Ⅰ型胶原蛋白α1链的真核表达及其与成纤维细胞的作用
  • [目的]构建鼠Ⅰ型胶原蛋白α1链(COL1A1)C端甘氨酸重复序列(氨基酸1 000~1 189)的真核表达载体,探究其与成纤维细胞(Rat-1)的相互作用。[方法]以COL1A1 c DNA为模板,PCR扩增甘氨酸重复序列基因,克隆至p AP-tag4载体上得到重组质粒,命名为p AP-Gly。将p AP-Gly转染至CHO细胞,Western Blot鉴定目的蛋白。用细胞原位和定量染色及配体受体亲和印迹实验探究其与Rat-1细胞的相互作用。[结果]p AP-Gly成功构建并表达,Western Blot检测到77k Da的目的条带。AP-Gly与Rat-1的原位染色及定量染色相对OD405值(OD405=1.157±0.066)表明其能与Rat-1结合。[结论]p AP-Gly成功构建并表达,融合蛋白能和Rat-1表面相互作用,为研究Ⅰ型胶原蛋白在成纤维细胞表面上的受体复合物奠定了基础。
  • 滚环转录结合定点切割制备小RNA的技术探究
  • [目的]优化滚环转录及定点酶切中关键技术,提高小RNA合成量。[方法]通过在引物与模板之间设计不互补部分,形成泡状凸起,引发滚环转录;使用天然DNAzyme 10-23定点剪切转录产物;另外改变RNase H酶切中Aid-DNA修饰核酸数目及位置,指导RNase H切割;DNaseⅠ降解模板DNA后,不经高温失活,直接进入RNase H酶切体系。[结果]由凸起结构引发转录,转录效率提高约5倍;RNase H在仅有3个修饰核酸间隔分布的Aid-DNA-3b辅助下,可高效定点剪切,而DNAzyme 10-23无法充分切割滚环转录产物;未失活的DNaseⅠ对Aid-DNA-3b的降解仅占8.7%,可直接进入RNase H酶切体系。[结论]引入凸起结构可提高转录效率约5倍;DNaseⅠ可直接进入酶切体系,随后使用Aid-DNA-3b介导酶切,产量可提高1.4倍。
  • 人TEAD1蛋白质的生物信息学分析
  • [目的]采用生物信息学方法对人TEAD1蛋白质的理化性质、跨膜区域、亲疏水性、信号肽区域、二级结构、三级结构、蛋白质之间的相互作用、GO注释进行预测分析。[方法]使用多种分析软件对TEAD1蛋白质进行预测分析。[结果]TEAD1蛋白质由426个氨基酸组成,等电点为8.33,在哺乳动物中高度保守;二级结构预测发现6个α螺旋和10个β折叠片层,三级结构预测结果的可靠性为100%,拉曼图分析表明预测结构稳定;与TEAD1相互作用的蛋白质主要是核内转录调控蛋白质,并可参与Hippo信号通路。[结论]TEAD1一种存在核定位序列、无跨膜结构的亲水不稳定蛋白质,具有转录调控因子的作用,可通过Hippo信号通路,表现出促癌作用。
  • 植物乳杆菌LY-78乳酸氧化酶基因克隆与生物信息学分析
  • [目的]对植物乳杆菌LY-78乳酸氧化酶基斟(lox)进行克隆及生物学信息学分析、[方法]PCR克隆lox基因,测序后采用多种生物学信息软件预测该基因对应蛋白的理化性质和结构特征。[结果]植物乳杆菌LY-78的乳酸氧化酶基因全长1101bp,编码366个氨基酸,其蛋白分子量38730.1Da,pI5.58,亲水性非分泌蛋白。该蛋白氨基酸序列系统进化树分析表明,该基闲序列保守性较高,可以反映近缘物种的亲缘关系;具有保守的α-羟基酸脱氢酶结合结构域。[结论]为揭示植物乳杆菌LY-78乳酸氧化酶的生理功能及在苯乳酸代谢机理中的作用提供了理论依据。
  • GmHIR1基因的功能预测及表达分析
  • [目的]获取GmHIR1相关生物信息学信息,分析与其他植物HIR的进化亲缘关系,进行启动子原件和结构的预测,分析其潜在调控功能,并研究该基因在疫霉菌侵染大豆过程中的表达情况。[方法]利用生物信息学软件对Gm—HIR1进行分析和功能预测,将大豆疫霉菌侵染抗病品种绥农10号和感病品种合丰25,分7个时间点进行取样,对Gm-HIR1的表达情况进行qRT—PCR分析。[结果]GmHIR1启动子含有11个作用元件,该基因编码蛋白含有stomatins和prohibitin两个结构域,表达分析表明GmHIR1在接种疫霉菌36h之前,在抗病品种绥农10号中表达明显增加,而在感病品种合丰25中变化不明显,36h之后,在两个品种的表达量变化趋势相似。[结论]GmHIR1与多种生理反应相关,并且确认GmHIR1与抗病大豆防御疫霉菌相关。
  • 鳞翅目昆虫Cry毒素受体与人同名蛋白的生物信息学分析
  • [目的]生物信息学分析鳞翅目昆虫Cry毒素受体氨肽酶N(APN)、类钙黏蛋白(CaLP)、碱性磷酸酶(ALP)与人同名蛋白的关系。[方法]NCBI数据库获取人和鳞翅目昆虫的APN、CaLP、ALP的氨基酸序列,利用生物信息学软件对序列一致性、系统发育关系、结构域、三维结构相似性等进行预测和分析。[结果]APN系统发育关系最近的是人与家蚕,两者序列一致性最高58.06%,含2个相似结构域,三维结构相似性显著(62.80%,P〈0.05)。ALP系统发育关系最近的是人与家蚕,两者序列一致性最高46.03%,含2个相似结构域,三维结构相似性显著(59.63%和59.59%,P〈0.05)。人与鳞翅目昆虫的CaLP系统发育关系较远;CaLP序列一致性最高是人与棉铃虫(28.12%),两者含2个相似结构域,三维结构相似性不显著(18.75%,P〉0.05)。[结论]人和家蚕两者间的APN、ALP系统发育关系最近,序列一致性最高,含有相似的结构域且三维结构相似性显著,可能具有相似的生物学功能。
  • 拟南芥类受体胞质激酶RBK2的生物信息学分析
  • [目的]对拟南芥类受体胞质激酶RBK2(ROP bindingprotein kinases2)的结构、分子进化和基因表达等进行预测分析。[方法]利用生物信息学在线相关数据库和分析软件对目的蛋白的基本理化性质、二级及三级结构、同源性、基因表达、蛋白定位、相互作用蛋白进行分析预测。[结果]拟南芥类受体胞质激酶RBK2是一个亲水性不稳定蛋白,主要构成原件为仅螺旋及B片状折叠,进化树构建及多序列比对显示其与琴叶拟南芥中名为激酶家族蛋白的蛋白进化距离最近。主要存在于细胞质和细胞核中,其编码基因在成熟花粉中强烈表达,且RBK2与PP2C家族蛋白有较强的相互作用。[结论]拟南芥RBK2很可能通过参与信号转导途径在植物种子萌发、花粉成熟及细胞分裂等方面发挥重要作用。
  • 抗大豆胰蛋白酶抑制剂单链抗体表达与纯化方法优化
  • [目的]利用大肠杆菌毒素蛋白VTB的五聚体化结构域(VT1B)及梭菌纤维素酶的纤维素结合结构域(CBD),异源表达其与抗大豆胰蛋白酶抑制剂单链抗体(anti-BBI Sc Fv)的融合蛋白,对该单链抗体表达与纯化方法进行优化。[方法]构建CBD-VT1B-anti-BBI Sc Fv融合蛋白大肠杆菌表达系统;应用Ni-NTA树脂与微晶纤维素两步亲和层析法提纯单链抗体融合蛋白。[结果]单链抗体融合蛋白在大肠杆菌中得到大量表达,通过两步纯化法获得了高纯度的融合蛋白,纯度比Ni-NTA树脂一步纯化法提高约12~34%;五聚体融合蛋白与纤维素的结合能力及蛋白纯化效率比单体蛋白提高约1倍。[结论]通过增加纤维素标签和五聚体化结构域,抗大豆胰蛋白酶抑制剂五聚体化单链抗体融合蛋白的纯化效果得到提高。
  • DNA改组技术提高低温脂肪酶Lip98热稳定性
  • [目的]提高来源于海洋微生物的低温脂肪酶Lip98的热稳定性。[方法]采用DNA改组技术进行低温脂肪酶的基因改造,连接到表达载体p ET-28a中构建小突变文库。经过活性筛选产酶重组菌株。在96孔板中进行两轮热稳定筛选突变株。[结果]经过2轮筛选,获得了两个突变株P92A和I199F。其突变位点分别是274位的C变成了G和595位的A变成了T。突变株50℃下的半衰期从24 min分别延长到38 min、85 min。[结论]DNA改组有效提高Lip98的热稳定性,半衰期提高到1.5~3.5倍,为酶的分子改造提供理论依据。
  • 糖基化对Caldicellulosiruptor sp.F32中内切型木聚糖酶热稳定性的影响
  • [目的]探讨糖基化对来自Caldicellulosiruptor sp.F32的GH11家族木聚糖酶的影响,揭示其工业应用价值。[方法]在大肠杆菌和毕赤酵母中表达木聚糖酶Xyn A及其催化模块Tm1。通过酶学性质对比,论证糖基化对酶学特征的影响。[结果]毕赤酵母分泌的p-Xyn A和p-Tm1可被糖基化修饰,而大肠杆菌表达的e-Xyn A和e-Tm1无法被修饰。糖基化未明显影响Xyn A的催化效率和热稳定性,但可提高Tm1的催化效率约1.5倍,而且在80℃、85℃下,pTm1的半衰期相对于e-Tm1分别提高了约1.5、2倍。另外,Tm1的热稳定性和酶活均显著高于Xyn A。通过对Tm1同源建模分析,两个糖基化位点(天冬酰胺N23、N189)可能对热稳定性有促进作用。[结论]酵母对Tm1的糖基化修饰可热稳定性和催化效率提高1.5~2倍,相比于Xyn A更适合工业应用。
  • [论著]
    罗非鱼补体C3基因的克隆及其表达分析(李晓恬[1,2];可小丽;卢迈新;刘志刚;王淼;庞纪彩[1,2])
    水稻线粒体延伸因子OsEF-Tu基因的克隆及表达(喻博伦;程钢;王春台;刘学群;刘海青;杨梦醒;谭艳平)
    肺炎支原体铁吸收调节蛋白基因的克隆表达与纯化(唐愈菲[1,2];游晓星;赵爽;黄泽智;李冉辉)
    马铃薯叶特异性启动子驱动的hIL-12在转基因马铃薯中表达(杨加伟;程小玲;龙朝康;张海桥)
    大肠杆菌γfiF基因原核表达系统构建、表达条件优化及蛋白纯化(张树军[1,2];狄建军;张国文)
    人TNFα和AP融合基因的表达、纯化及功能鉴定(韩虎子;李有为;徐阳;梁朋[1,2])
    Ⅰ型胶原蛋白α1链的真核表达及其与成纤维细胞的作用(漆佳丽;冯海燕;梁朋[1,2])
    [技术与方法]
    滚环转录结合定点切割制备小RNA的技术探究(李灿;王星宇;王静;潘孝明;董平;梁兴国)
    人TEAD1蛋白质的生物信息学分析(王兆松;赵文铖;张连民;周蒙;魏梅;董秋萍;许世磊)
    植物乳杆菌LY-78乳酸氧化酶基因克隆与生物信息学分析(李芬;梁茜茜;孙大庆[1,2];张丽萍[1,2])
    GmHIR1基因的功能预测及表达分析(刘洋;辛大伟;付营;李长育;张艳娇;于仁敬;刘丽敏;陈琳;刘春燕;蒋洪蔚;陈庆山)
    鳞翅目昆虫Cry毒素受体与人同名蛋白的生物信息学分析(陈贵东[1,2];李燕芳;何颖;邹泽红;陶爱林)
    拟南芥类受体胞质激酶RBK2的生物信息学分析(易黎;曹刚强;位芳;李瑞;梁秋霞)
    [开发与应用]
    抗大豆胰蛋白酶抑制剂单链抗体表达与纯化方法优化(刘玉婷;王琼;谢亮;程小玲;彭静;屈品均;辛化伟)
    DNA改组技术提高低温脂肪酶Lip98热稳定性(苏宏飞[1,2];麦志茂;张偲)
    糖基化对Caldicellulosiruptor sp.F32中内切型木聚糖酶热稳定性的影响(王灵[1,2];韩文杰;孟冬冬;朱静;李福利;吕明)
    《生物技术》封面

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