设为首页 | 加入收藏
文献检索:
  • 狗Toll样受体5基因的克隆与序列分析
  • [目的]克隆狗TLR5基因,应用生物信息学软件对其进行结构和功能的预测分析。[方法]依据Gen Bank中已公布的狗TLR5基因的CDS区设计出特异性引物。PCR扩增获得狗TLR5目的基因,并构建重组质粒p CR2.1-Dog TLR5,测序正确后应用生物信息软件分析其序列特征。[结果]克隆得到的基因序列与Gen Bank中登录的狗TLR5(NC 006620.3)的同源性高达99%。狗TLR5的ORF为2 577 bp,编码858个氨基酸,蛋白分子质量约94.675 7 kDa,理论等电点为8.57,不稳定系数为43.14,表明为不稳定蛋白。狗TLR5蛋白N端的前20个氨基酸构成了其信号肽序列。核苷酸序列同源性比对结果表明,狗的TLR5基因序列与大熊猫、雪豹、东北虎和猎豹TLR5基因同源性相对于其他比对物种较高,分别为78.7%、77.2%、76.8%和76.3%。[结论]成功克隆出狗TLR5基因,生物信息学分析表明狗TLR5基因与Toll样受体家族具有相似的结构特征。狗TLR5基因的成功克隆与序列分析为进一步研究其在分子免疫方面的作用机制奠定了基础。
  • 基于重叠延伸PCR构建幽门螺杆菌MreB重组载体
  • [目的]基于重叠延伸PCR技术,构建串联亲和层析标签(TAP)标记的幽门螺杆菌骨架蛋白Mre B的重组质粒。[方法]将幽门螺杆菌Mre B基因终止密码子TAA前DNA序列(Mre Ba)、TAP和终止密码子TAA后的DNA序列(Mre Bb),通过重叠延伸PCR进行连接,形成大小约3.1 kb的融合片段Mre BCF;Mre BCF片段经XhoⅠ酶切、纯化后,克隆到经SmaⅠ和XhoⅠ双酶切的线性载体p K18mob Sac B上。[结果]PCR、酶切及DNA测序的结果表明,重组质粒p K18Mre BCF包含大小约为740 bp、1 400 bp和1 000 bp的三个片段(Mre Ba、TAP和Mre Bb),并且这三个片段的接头连接及核苷酸序列完全正确。[结论]利用重叠延伸PCR可对多个片段进行无缝连接,简便、高效地构建重组质粒;成功构建了重组质粒p K18Mre BCF,为将来幽门螺杆菌Mre B蛋白功能复合体的分离和鉴定奠定了基础。
  • SUSD2基因真核表达载体构建及其在H322细胞中表达
  • [目的]构建SUSD2基因真核表达载体,并观察其在真核细胞H322细胞中的表达。[方法]从H322细胞中提取总RNA并逆转录为c DNA,采用PCR技术扩增出含有EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的人SUSD2基因片段,以质粒pc DNA3.1为表达载体,构建重组质粒pc DNA3.1-SUSD2。采用PCR、双酶切鉴定以及测序验证c DNA片段大小和序列正确。将重组载体pc DNA3.1-SUSD2转染H322细胞,Western Blot法检测SUSD2蛋白的表达。[结果]PCR、双酶切鉴定以及测序结果显示pc DNA3.1-SUSD2包含大小、序列正确的SUSD2片段;Western Blot结果显示SUSD2蛋白在转染pc DNA3.1-SUSD2的H322细胞中表达高于转染pc DNA3.1的H322细胞。[结论]成功获得SUSD2基因全长序列,并成功构建SUSD2基因真核表达载体,有效地在非小细胞肺癌细胞株H322中表达,为进一步研究该基因功能及机制奠定了基础。
  • 丹参水杨酸结合蛋白基因的克隆、表达分析
  • [目的]从丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)培养细胞中克隆水杨酸结合蛋白(salicylic acid binding protein 2,SABP2)基因Sm SABP2并对其进行表达分析。[方法]用Trizol法提取丹参细胞总RNA,反转录得到c DNA,通过PCR扩增Sm SABP2,将其连接到p MD-19T simple载体中,利用酶切连接的方法构建p ET28a-Sm SABP2原核表达载体,再转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,检测蛋白酯酶活性。利用RT-q PCR测定水杨酸处理2 h的丹参悬浮细胞中Sm SABP2的表达量。[结果]PCR扩增获得了长度为780 bp的Sm SABP2,成功构建了原核表达载体p ET28aSm SABP2,IPTG诱导得到了Sm SABP2,SDS-PAGE电泳结果显示诱导8 h优于4 h,q PCR检测发现水杨酸处理2 h内Sm SABP2相对表达量持续升高。[结论]从丹参培养细胞中克隆了大小为780 bp的Sm SABP2,成功表达出了有活性的Sm SABP2,并且该基因能够强烈响应水杨酸诱导。
  • 西瓜GGPS基因果实特异性表达载体构建与遗传转化
  • [目的]将牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPS)基因转化西瓜。[方法]利用RT-PCR技术克隆西瓜果实GGPS基因CDS区;构建由果实特异性启动子AGPL1调控GGPS基因、以nptⅡ为筛选标记基因的植物表达载体,并转入农杆菌EHA105;通过农杆菌介导法对西瓜品种“红一号”进行遗传转化。[结果]经过卡那霉素筛选和PCR初步鉴定,获得4株转基因阳性植株。[结论]构建了GGPS基因果实特异性表达载体,并将其转入西瓜品种“红一号”中,转化效率为0.13%。
  • FGF20原核表达载体构建及在大肠杆菌中优化表达
  • [目的]构建人FGF20原核表达载体并在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)中优化表达。[方法]从胃癌细胞中经RT-PCR扩增FGF20基因并构建p ET28b-FGF20载体,转化E.coli,IPTG诱导表达。对诱导OD值、IPTG浓度、诱导温度、时间及溶氧量进行优化,同时采用正交试验优化培养基配方,以SDS-PAGE及Western Blot检测蛋白表达,以确定最佳表达条件。[结果]构建了p ET28b-FGF20原核表达载体,实现了FGF20蛋白的表达,确定最佳表达条件为:培养基占锥形瓶容积20%,菌体生长至OD600=0.4,加入终浓度1.0 mmol/L的IPTG,37℃诱导6 h。培养基最佳成分为:蛋白胨11 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠10 g/L、葡萄糖0 g/L。[结论]实现了FGF20在大肠杆菌中的优化表达,为其基因工程药物生产及药用研究奠定了基础。
  • hMTERF3基因慢病毒载体的构建及在宫颈癌HeLa细胞中的表达
  • [目的]研究显示人线粒体转录终止因子3(human mitochondrial transcription termination factor 3,h MTERF3)基因表达异常在肿瘤发生发展中具有重要意义。该研究旨在构建h MTERF3基因慢病毒表达载体,建立稳定过表达h MTERF3基因的人宫颈癌He La细胞株。[方法]采用RT-PCR技术从HEK293细胞中克隆出h MTERF3基因c DNA开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,使目的基因连接入载体质粒中,构建成重组慢病毒载体质粒。对重组慢病毒载体质粒进行PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序鉴定后,制备包装病毒病感染人宫颈癌He La细胞株,通过药物筛选及维持稳定过表达h MTERF3基因的He La细胞株。倒置荧光显微镜下观察转染后各组细胞中绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的表达情况,RT-q PCR检测转染后各组细胞中h MTERF3基因的表达水平。[结果]成功构建了含有h MTERF3基因c DNA ORF序列的载体质粒p Lenti6.3-h MTERF3-IRES2-EGFP,DNA测序结果完全正确,经慢病毒包装后所得病毒上清液的滴度为1.1×10^9TU/m L。稳转He La细胞株在荧光显微镜下可见GFP表达,RTq PCR实验证实稳定转染重组慢病毒后He La细胞中h MTERF3 mRNA水平比未转染细胞极显著增高(P〈0.01)。[结论]成功构建了适用于h MTERF3基因研究的慢病毒表达系统,构建了稳定过表达h MTERF3基因的宫颈癌He La细胞株,从而为研究宫颈癌的基因诊治提供了一定的实验依据。
  • 人GRB2基因真核表达及其在293T细胞中的定位研究
  • [目的]构建人GRB2蛋白真核表达质粒p Enter-GRB2,并观察其在293T细胞中的定位。[方法]从Hela细胞中提取总RNA,通过RT-PCR获得GRB2全长c DNA序列,并将其克隆到真核表达载体p Enter中,构建重组质粒p Enter-GRB2。转染293T细胞24 h、36 h和48 h后通过Western Blot检测其表达情况,通过免疫荧光观察其在细胞中的定位情况。[结果]经双酶切及测序鉴定,GRB2开放阅读框正确地构建到了真核表达质粒p Enter中,免疫印迹检测可见大小约为25 k Da的特异性条带,免疫荧光实验表明GRB2蛋白在细胞质和细胞核中均存在。[结论]成功构建了真核表达质粒p Enter-GRB2并在293T细胞中表达,证实GRB2在293T细胞中不仅存在于细胞质中,也存在于细胞核中,为更加深入地研究其生物学功能及机制奠定了理论基础。
  • 高质量人体粪便细菌16S rDNA V3区扩增方法
  • [目的]为获得应用于二代测序的高质量16S r DNA V3区PCR产物。[方法]以从人体粪便中提取微生物总DNA为模板,通过梯度PCR和touchdown PCR技术确定了循环条件,并通过调整反应体系中的相关浓度参数以使扩增结果得到优化。[结果]最终确定的循环条件为预变性95℃3 min,变性95℃30 s,退火69℃-62℃每个循环退火温度降0.5℃,退火时间30 s,延伸72℃60 s,共15个循环;变性95℃30 s,退火62℃30 s,延伸72℃60 s,共15个循环,最后72℃延伸5 min。反应体系为:在50μL体系中DNA模板量10-25 ng,pfu酶0.25-0.5 U,正反向引物均为0.06-0.1μmol/L,d NTPs浓度0.2-0.4 mmol/L,Mg2+浓度2-2.5 mmol/L。[结论]梯度PCR与touchdown PCR相结合可快速确定最佳的退火温度以及循环条件,通过调整反应体系中浓度参数可以解决扩增中一些问题。
  • 极端嗜盐古菌Natrinema sp.J7-2的转录组学研究
  • [目的]从转录组的角度研究极端嗜盐古菌Natrinema sp.J7-2的盐适应性。[方法]利用Illumina Hi Seq 2000双末端测序技术对生长在不同盐浓度下(15%Na Cl、25%Na Cl、30%Na Cl)的Natrinema sp.J7-2的转录组测序分析,并对差异表达基因进行了GO与KEGG富集。[结果]转录组测序结果表明,培养在3种不同盐浓度下的Natrinema sp.J7-2差异表达基因主要富集到氨基酸代谢、卟啉与叶绿素代谢两条途径上,氨基酸代谢主要涉及谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸代谢;在3组盐培养物中,有1 320个基因存在差异,其中83个共同差异表达的基因。[结论]通过转录组分析揭示Natrinema sp.J7-2菌株主要通过调控氨基酸代谢与能量代谢来适应不同盐环境。
  • 拟南芥胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的表达模式分析
  • [目的]研究拟南芥胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase;At GAPDH)基因家族成员的生理功能和表达模式。[方法]利用生物信息学法分析At GAPDH1和At GAPDH2的启动子元件;借助序列克隆、植物转基因技术、以及GUS活性检测技术分析At GAPDH1和At GAPDH2在植物内表达模式。[结果]启动子序列生物信息学分析表明At GAPDH1和At GAPDH2启动子分别具有相同的和基因特异的调控元件;启动子融合GUS活性检测表明At GAPDH1和At GAPDH2具有不同的表达模式。[结论]通过对At GAPDH基因家族成员的表达模式的分析,初步确定了基因家族成员功能的特化与其序列和表达模式的相关性。
  • 人TRIM28基因及蛋白质的生物信息学分析
  • [目的]通过生物信息学预测分析人TRIM28基因的启动子及蛋白质的理化性质、信号肽、亲疏水性、跨膜区域、蛋白结构、与之相互作用的蛋白质及功能。[方法]使用相应软件分析TRIM28相关信息。[结果]TRIM28的3个启动子中第一个通过甲基化对其表达影响较深;TRIM28蛋白质是由835个氨基酸组成的无信号肽、无跨膜结构的不稳定亲水蛋白质,等电点为5.52,哺乳动物中高度保守;二级结构包括10个α螺旋和12个β折叠片层,三级结构构建需更多可靠的模板;TRIM28主要定位于细胞核,自身及相互作用蛋白质主要参与染色质修饰及DNA损伤修复过程。[结论]TRIM28第一个启动子甲基化影响其表达,蛋白质无信号肽、无跨膜结构、不稳定系数高达46.43,属不稳定亲水蛋白质,定位细胞核,参与染色质修饰和DNA损伤修复。
  • 贵州地方山羊RBP4基因多态性及生物信息学分析
  • [目的]对贵州黑山羊和黔北麻羊进行RBP4基因多态位点的筛选,为从分子水平探究RBP4基因对动物繁殖性能的调控机制提供理论依据。[方法]采用DNA混池结合直接测序法分析RBP4基因外显子4在贵州黑山羊和黔北麻羊中的单核苷酸多态性,利用生物信息学软件分析SNP位点对RBP4基因mRNA二级结构的影响。[结果]RBP4基因外显子4在贵州黑山羊和黔北麻羊中均存在4-T214C突变位点,且为同义突变。生物信息学分析结果表明,外显子4-T214C突变导致RBP4基因mRNA二级结构发生变化,自由能降低,结构稳定性增大。[结论]在贵州黑山羊和黔北麻羊中检测到RBP4基因外显子4的1个SNP位点,该突变位点影响了RBP4基因mRNA的二级结构。
  • 大麦根部快速稳定转化体系的建立
  • [目的]为了解决大麦根组织与根际微生物(有益菌或致病菌)互作分析系统的缺失,建立了大麦根部快速稳定遗传转化系统。[方法]显微镜下通过分离大麦未成熟幼胚并剥离胚轴,对大麦幼胚实施含有外源基因GFP、Hv EXPANSINB1-RNAi、BAX INHIBITOR-1以及GFP-ER的农杆菌转化,将大麦幼胚分别转入愈伤培养基和生根培养基进行根组织的诱导。[结果]大量的根可以在6 w时间内被成功诱导。利用该体系:实现GFP在根中表达;转有Hv EXPANSINB1-RNAi基因的根毛数量显著减少;经BAX INHIBITOR-1基因转化的根组织减少了病原菌Fusarium graminearum的定殖;成功地检测到了GFP-ER基因在内质网及细胞核周围的定殖。[结论]该体系可成功应用于外源基因的表达、沉默,大麦根部功能基因与病原菌的互作以及蛋白的亚细胞定位研究。
  • 利用慢病毒载体建立一种Alzheimer's症体外模型
  • [目的]以大鼠原代培养的海马神经元为基础,建立一种阿尔兹海默症(Alzheimer's Disease,AD)体外疾病模型。[方法]利用分子克隆技术,构建带有Swedish突变的AD致病相关基因APP的慢病毒载体系统,将其导入原代培养的大鼠海马神经元。[结果]在APP野生型中了引入Swedish突变,成功构建APPSwe慢病毒载体系统,并在大鼠原代海马神经元中实现高表达。[结论]慢病毒系统能够将阿尔兹海默症致病相关基因Swedish突变APP导入大鼠原代海马神经元中,并且与对照组相比APP表达量为263.9±18.3%,为进一步研究阿尔兹海默症的致病机制以及寻找可能的治疗手段建立了一种体外评价模型。
  • 干扰RN181基因的表达抑制SMMC7721肝癌细胞的凋亡
  • [目的]探讨稳定干扰RN181基因对顺铂诱导的SMMC7721肝癌细胞凋亡的影响。[方法]采用RN181干扰慢病毒感染SMMC7721,流式分选出带绿色荧光的细胞,Western Blot鉴定RN181干扰情况;采用DAPI染色法、Western Blot检测RN181对顺铂诱导SMMC7721肝癌细胞凋亡的变化情况。[结果]重组细胞株荧光表达良好,7721KD中RN181蛋白表达量明显低于其对照组。DAPI染色法观察到在顺铂作用下,7721KD的细胞凋亡阳性率低于其对照组(P〈0.05)。WB检测到7721KD activated caspase-3、cleaved PARP的表达量低于对照组,而pro-caspase-6、pro-caspase-8的表达量与对照组相比升高。[结论]稳定干扰RN181的表达能够抑制顺铂诱导的SMMC7721细胞凋亡,其机制可能是通过参与死亡受体凋亡途径。
  • 人参皂甙Rb1调节microRNA-21保护心肌细胞的作用
  • [目的]研究microRNA-21(miR-21)及其靶蛋白PDCD4在人参皂甙Rb1(GS-Rb1)保护缺血缺氧损伤心肌细胞中的作用。[方法]通过缺血缺氧无糖培养24 h构建心肌细胞损伤模型,利用5-40μmol/L的GS-Rb1与模型组细胞共同作用后,采用MTT和Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞活性和凋亡率,荧光定量PCR法检测miR-21的表达,Western Blot法检测PDCD4蛋白的表达。[结果]GS-Rb1呈剂量依赖性保护心肌细胞,细胞活性由模型组的25.7%上升至53.3%。流式分析表明GS-Rb1使缺血缺氧造成的心肌细胞凋亡率由81.5%下降至31.0%;miR-21在模型组的表达下降了36.4%,GS-Rb1可以抑制miR-21的表达下降;在模型组中,PDCD4蛋白的表达上升了8.9倍,并可被GS-Rb1抑制。[结论]GS-Rb1可以减轻缺血缺氧引起的心肌细胞凋亡,并逆转了miR-21的下调及靶蛋白PDCD4的表达上调。
  • [论著]
    狗Toll样受体5基因的克隆与序列分析(胡素娟;仇永凤;朱爱华;田俊;周郑坤;刘伟杰)
    基于重叠延伸PCR构建幽门螺杆菌MreB重组载体(李芳;高婧;马金成;范聪聪;付亚娟[1,2];侯晓强[1,2])
    SUSD2基因真核表达载体构建及其在H322细胞中表达(蔡翠霞;刘心蕊;王涵多;高媛;王飞)
    丹参水杨酸结合蛋白基因的克隆、表达分析(李秀红;刘海龙;曹瑞致;孙伟康;董娟娥)
    西瓜GGPS基因果实特异性表达载体构建与遗传转化(吕品[1,2];李朋伟;马双武;赵文恩)
    FGF20原核表达载体构建及在大肠杆菌中优化表达(张磊;吕英;宋玉;王会岩)
    hMTERF3基因慢病毒载体的构建及在宫颈癌HeLa细胞中的表达(熊伟[1,2];孙美涛[1,2];王昀[1,2];杨勇琴;张海洋;张晓娟)
    人GRB2基因真核表达及其在293T细胞中的定位研究(熊玉锋;郝文波;张佳凤;陈达香;徐岚;李明)
    [技术与方法]
    高质量人体粪便细菌16S rDNA V3区扩增方法(贾彦;江岩;明珠;赵培;庞广昌;闫亚丽;陈庆森)
    极端嗜盐古菌Natrinema sp.J7-2的转录组学研究(梅运军;邓威;张顺喜;胡纯;沈萍)
    拟南芥胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的表达模式分析(张霞[1,2];苏豫梅;邓莉;张富春)
    人TRIM28基因及蛋白质的生物信息学分析(马素珍;张方方;刘丹丹;潘晓丽;刘胜利;郝万清;张海燕)
    贵州地方山羊RBP4基因多态性及生物信息学分析(邓位喜;孙振梅;李鹏程;冯文武;陈祥)
    [开发与应用]
    大麦根部快速稳定转化体系的建立(李亮;王晓阳;主朋月;穆迪;武洪庆;齐树亭)
    利用慢病毒载体建立一种Alzheimer's症体外模型(叶旋;泰文娇;孙士鹏;张丹)
    干扰RN181基因的表达抑制SMMC7721肝癌细胞的凋亡(石相宜;王穗海;彭迎霞;高彦君;董宁宁;何沛嵘;牛文博;吴英松;李明;李纪良)
    人参皂甙Rb1调节microRNA-21保护心肌细胞的作用(闫旭;吴红金;袁芳)
    《生物技术》封面

    主管单位:黑龙江省科学院

    主办单位:黑龙江省微黑龙江省科学院微生物研究所

    主  编:沙长青

    地  址:哈尔滨市道里区兆麟街68号

    邮政编码:150010

    电  话:0451-84615121

    电子邮件:swjszz@163.com swjszzxxw@163.com

    国际标准刊号:issn 1004-311x

    国内统一刊号:cn 23-1319/q

    邮发代号:14-225

    单  价:10.00

    定  价:60.00


    关于我们 | 网站声明 | 合作伙伴 | 联系方式 | IP查询
    金月芽期刊网 2019 触屏版 繁體版 电脑版 京ICP备13008804号-2