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CTGF mRNA在糖尿病大鼠心肌中的表达及葛根素和氨基胍的调节作用


摘 要:

目的:观察结缔组织生长因子(CTGF)在糖尿病大鼠心肌组织中的表达情况及葛根素(Pue)、氨基胍(AG)对CTGF表达的调节作用。方法:给大鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)制备糖尿病模型,用葛根素(Pue1组,160mg·kg^-1·d^-1;Pue2组,120mg·kg^-1·d^-1;Pue3组,80mg·kg^-1·d^-1)、氨基胍(AG组,100·kg^-1·d^-1)治疗12周;采用RT-PCR检测心肌组织CTGF mRNA的表达,透射电镜下观察心肌细胞的形态学改变。结果:糖尿病组大鼠心肌组织CTGF mRNA的表达升高,Pue2组、Pue3组和AG组CTGF mRNA的表达明显降低;电镜下可见糖尿病组大鼠心肌细胞肌原纤维含量明显减少,治疗组大鼠心肌病变明显减轻。结论:葛根素(120和80mg·kg^-1·d^-1)和氨基胍能下调CTGF mRNA的表达,对糖尿病大鼠心肌具有保护作用。

作者单位:(温州医学院,浙江 温州 325035,1.生物学实验教学中心;2.生物化学教研室)

【摘要】  目的 :观察结缔组织生长因子(ctgf)在糖尿病大鼠心肌组织中的表达情况及葛根素(pue)、氨基胍(ag)对ctgf表达的调节作用。方法:给大鼠腹腔注射链脲佐菌素(stz)制备糖尿病模型,用葛根素(pue1组,160 mg·kg-1·d-1;pue2组,120 mg·kg-1·d-1;pue3组,80 mg·kg-1·d-1)、氨基胍(ag组,100 mg·kg-1·d-1)治疗12周;采用rt-pcr检测心肌组织ctgf mrna的表达,透射电镜下观察心肌细胞的形态学改变。结果:糖尿病组大鼠心肌组织ctgf mrna的表达升高,pue2组、pue3组和ag组ctgf mrna的表达明显降低;电镜下可见糖尿病组大鼠心肌细胞肌原纤维含量明显减少,治疗组大鼠心肌病变明显减轻。结论:葛根素(120和80 mg·kg-1·d-1)和氨基胍能下调ctgf mrna的表达,对糖尿病大鼠心肌具有保护作用。

【关键词】  结缔组织生长因子;葛根素;氨基胍;糖尿病;心肌;基因;大鼠

expression of ctgf mrna in myocardium in diabetic rats and the adjusting function of puerarin and aminoguanidine dong min*, chen xiu-fang, fang zhou-xi. *central laboratory of biology,wenzhou medical college,wenzhou,325035

  abstract: objective: to observe the mrna expression of the connective tissue growth factor(ctgf) in myocardial tissue in rats with diabetes mellitus (dm) and the adjusling effects of puerarin (pue) and aminoguantdine (ag) on ctgf expression.methods: the diabetes mellitus (dm) rats models were made by intraperitoneal injection of streptozotocin (60 mg/kg body weight), then treated with pue and ag. after 12 weeks, the rats were sacrificed. the expression of ctgf mrna of myocardial tissue were determined with reverse transcription polymerase chain reaction (rt-pcr). morphology of myocardium of rats were also observed under transmission electron microscope (tem). results: the ctgf mrna expres-sion was significantly higher in dm group than those in nc group and pue treated(120 mg·kg-1·d-1、80 mg·kg-1·d-1)and ag treated groups (p<0.01). it showed that myofibrilla contents in myocardial cell decreased significantly under tem in diabetic group. the pathological changes of myocardium which induced by diabetes were reversed in different doses of pue treated groups and ag treated groups. conclusion: the protective effect of pue and ag on myocardium of diabetic rat may be down-regulated through decreasing the level of ctgf mrna expression.

  key words: connective tissue growth factor;puerarin;aminoguanidine;diabetes mellitus; myocardium;gene expression;rat

  糖尿病心肌病(dcm)是糖尿病最常见的慢性并发症之一,被认为是糖尿病死亡的首要因素。已有研究表明,糖尿病心肌病变以舒张功能异常为早期临床特征,间质纤维化是其发生的主要原因[1]。结缔组织生长因子(ctgf)是新近发现的与纤维化形成密切相关的细胞因子[2]。近年来有研究提示ctgf参与了心肌纤维化的发生[3-4]。本研究观察了ctgf在糖尿病大鼠心肌组织中的表达情况以及葛根素和氨基胍对ctgf mrna表达的影响。

  1 材料和方法

  1.1 动物、试剂与仪器 清洁级(ii级)sprague-dawley大鼠70只,体重180~220 g,2月龄(本院实验动物中心提供)。链脲佐菌素(streptozotocin,stz)、氨基胍均为美国sigma公司产品,葛根素注射液(2 ml:0.1 g)为浙江康恩贝制药有限公司产品;trizol reagent rna提取试剂盒、rt-pcr试剂盒、dna marker由宝生物工程(大连)有限公司提供;ctgf及gapdh(3-磷酸甘油醛脱氢酶)引物序列由上海生物工程技术服务有限公司合成;血糖仪及测试条由强生(中国)医疗器材有限公司提供。

  1.2 动物分组和处理 随机取10只大鼠作为对照组(c组),余60只大鼠禁食12 h后,用链脲佐菌素60 mg/kg一次性左下腹腔注射,72 h后取尾血用快速血糖仪测血糖,≥16.8 mmol/l为糖尿病大鼠。成模后再将糖尿病大鼠随机分为5组:糖尿病组(dm组)、葛根素高剂量(160 mg·kg-1·d-1)治疗组(pue1组)、葛根素中剂量(120 mg·kg-1·d-1)治疗组(pue2组)、葛根素低剂量(80 mg·kg-1·d-1)治疗组(pue3组)、氨基胍治疗组(ag组,100 mg·kg-1·d-1)。c组及dm组每天腹腔注射丙二醇,容积为2 ml/kg,其余各组大鼠每天在相同时间内腹腔注射相应的药物,于同等条件下饲养12周。大鼠给药处理12周后,股动脉放血处死,开胸取出心脏,留取电镜标本后,迅速用4 ℃生理盐水冲洗血液,放入液氮中速冻过夜后移至-70 ℃冰箱中保存备用。

  1.3 心肌组织ctgf mrna表达的测定 取冻存的心肌组织,经trizol一步法提取总rna,紫外分光光度法定量后,按照逆转录试剂盒说明,以oligo(dt)为引物合成cdna,于-20 ℃保存备用。根据genebank资料,以ctgf mrna和gapdh mrna为模板,用软件primer 3设计引物如下:ctgf 上游5’-gcaaatagcctgtcaatctc-3’,下游5’- tccataaaaatctggcttgt-3’,扩增产物长度为414 bp;gapdh上游5’-actcagaagactgtggatgg-3’,下游5’-tgttgaagtcacaggagaca-3’,产物长度为313 bp。优化pcr条件,进行ctgf与gapdh的共扩增。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像仪观察,用image master软件半定量分析条带峰面积,计算ctgf与gapdh峰面积的比值。

  1.4 心肌组织超微结构观察 大鼠处死后立即取左心室心肌,用锋利双刃刀片切成1 mm ×1 mm ×1 mm,迅速置2.5%戊二醛于4 ℃固定1 h,于常规pbs漂洗、丙酮梯度脱水,epon812包埋,lkb-v型超薄切片机切片,铅铀双重染色,hitachi 7500型透射电镜下观察。

  1.5 统计学处理方法 采用单因素方差分析,组间两两比较采用lsd检验。

  2 结果

  2.1 各组大鼠心肌组织ctgf mrna表达的变化 dm组ctgf mrna表达显著高于c组(p<0.01);pue1组与dm组比较,差异无显著性(p>0.05);pue2、pue3组明显低于dm组(均p<0.01),与c组比较,差异无显著性(p>0.05);ag组明显低于dm组,但仍高于c组(均p<0.01))。见表1和图1。

  2.2 各组大鼠心肌组织超微结构的变化 c组大鼠心肌间无胶原沉积。dm组大鼠心肌纤维外间隙增宽,内中胶原纤维沉积。ag组大鼠心肌血管周围有局灶性胶原纤维增生。pue1组心肌纤维间局灶性胶原纤维增生。pue2组心肌血管周围没有胶原纤维增生。pue3组心肌纤维间隙小,无胶原纤维增生。见图2。

  3 讨论

  近年来,有关dcm的发病机制研究中,细胞因子网络逐渐成为人们的研究热点。ctgf是一种富含半胱氨酸的分泌性多肽,是近年发现的一种新的致纤维化生长因子,具有广泛的生物学作用。它可促进细胞的黏附、增生和细胞外基质形成,参与细胞周期调控、血管发生、心血管重构及多种脏器的纤维化过程。在生理情况下,心、脑、肾等组织中可有基础量的ctgf分泌,而在高血压、动脉粥样硬化病变中以及心肌梗死灶中ctgf表达明显增高,并与纤维化指标呈正相关,提示ctgf可能是致心肌纤维化的关键性中间环节[5-6]。赖鹏斌等[7]发现,糖尿病大鼠心肌ctgf mrna表达显著上调,随着病程延长呈逐渐增高趋势,并与纤维连接蛋白、ⅲ型胶原的表达水平升高相关。本实验结果也表明,糖尿病组大鼠ctgf mrna 表达显著增强,提示ctgf参与糖尿病心肌纤维化的过程。

  葛根素(puerarin, pue)是从豆科多年生落叶藤本植物野葛或甘葛藤的根中提取的单体异黄酮化合物,其化学名为8-β-d-葡萄吡喃糖-4’,7-二羟基异黄酮。现代药理研究表明,pue能扩张冠脉,降低血液黏度,抑制血小板凝集,降低血栓素a2的水平,改善心肌的缺血、低氧;并能抑制蛋白非酶糖基化,抗氧自由基损害[8-9],调节血脂,降低血糖,其对糖尿病的治疗作用正逐渐受到重视。本实验结果显示,糖尿病大鼠予以葛根素120 mg·kg-1·d-1、80 mg·kg-1·d-1治疗12周后,心肌ctgf mrna表达明显降低,提示适当剂量的葛根素能在一定程度上延缓糖尿病大鼠心肌的纤维化进程。ag为亲核肼类化合物,能通过抑制ages形成及阻止ages与受体的相互作用而减少ctgf表达[10]。本实验中,ag组与dm组比较ctgf mrna表达亦显著下降,可能是通过以上机制起作用。而葛根素对ctgf mrna 表达的作用机制尚需进一步研究探讨。

【参考文献】 ......(未完,请点击下方“在线阅读”)

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