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大鼠离体肺再灌注模型的建立和改进


□ 魏以桢 吴清玉 史世勇

摘 要:

目的本实验利用微创方法建立大鼠离体肺灌注模型。方法将一只受体大鼠股动脉、颈静脉插管,引流出静脉血灌注低温保存后的供体肺,氧合后的血液回输入受体大鼠体内。每只受体大鼠建立控制性交叉循环后,灌注一只供体肺1 h,取股静脉流出血样测定pH、PO2、PCO2和Hb的变化情况。结果各组间pH、PO2、PCO2和Hb经统计学分析无明显差异(P〉0.05)。结论控制性交叉循环下受体大鼠血流动力学稳定,能够较长时间地提供符合生理状态的静脉化全血。可用于供体肺保存及缺血再灌注损伤的研究。

作者单位:1.中国医学科学院阜外心血管病研究所阜外心血管病医院,北京 100037;2.清华大学华信医院心脏中心,北京 100016

【摘要】    目的 本实验利用微创方法建立大鼠离体肺灌注模型。方法 将一只受体大鼠股动脉、颈静脉插管,引流出静脉血灌注低温保存后的供体肺,氧合后的血液回输入受体大鼠体内。每只受体大鼠建立控制性交叉循环后,灌注一只供体肺1 h,取股静脉流出血样测定ph、po2、pco2和hb的变化情况。结果 各组间ph、po2、pco2和hb经统计学分析无明显差异(p>0.05)。结论 控制性交叉循环下受体大鼠血流动力学稳定,能够较长时间地提供符合生理状态的静脉化全血。可用于供体肺保存及缺血再灌注损伤的研究。

【关键词】  动物模型 肺移植 供体 缺血再灌注

  establishment and modification of isolated lung transplantation and

    reperfusion model in rats

    wei yi-zhen1 ,wu qing-yu2 , shi shi-yong1 

    ( 1.fuwai hospital,fuwai heart institute,chinese academy of medical sciences,beijing 100037;

    2.heart center of huaxin hospital,tsinghua university,beijing 100016,china)

    abstract: objective  to establish and modify of the isolated lung transplantation and reperfusion model in rats with a relatively less-invasive way. methods  angiocatheters were inserted into femoral artery and jugular vein of the recipient rat to establish the controlled cross-circulatory. the venous cannula was connected to the pulmonary artery of the ex vivo lung block after preservation and cold storage to provide inflow,and pulmonary effluent blood from the lung block was collected and returned to the support rat via the femoral artery for detoxification and deoxygenation. each support rat was used to perfuse one lung block for at least one hour. the inflow sample to each lung block was analyzed for ph, po2, pco2, and hb to follow alterations in support rat physiology. results  there were no statistical differences in ph, pvo2, pvco2 or hb (p>0.05). conclusion  the support rat can deliver constant systemic venous blood at stable physiologic parameters to the ex vivo lung block and this animal model can be used in research of lung transplantation and ischemic-reperfusion injury.

    key words:  animal model; lung transplantation;donor;ischemic-reperfusion injury;

    目前,肺移植已成为一种治疗多种终末期肺部疾患的有效手段。但早期移植物功能障碍(primary graft failure,pgf)的发生始终是手术失败的主要原因,与移植后并发症发生率及病死率明显相关[1-2]。pgf病因复杂,降低pgf发生率的努力多集中在延长供体肺保存时间以及减轻供体肺缺血再灌注方面。原位大动物肺移植模型操作复杂,技术要求高,维护成本较高,且失败率高,小动物的体外循环(extracorporeal circulation,ecc)模型较少报道[3-4]。因此,建立一种简单可靠、重复性好、费用低廉的动物模型来评价肺保存及再灌注效果非常必要。本实验利用微创方法建立大鼠离体肺灌注模型,为开展大鼠肺移植手术供体肺保存及术后缺血再灌注损伤等研究提供了一种选择。

    1  材料与方法 

    1.1  材料  清洁级纯种健康雄性sd大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司提供,实验动物机构许可证号:scxk(京)2002-0003),体重300~350 g。1%戊巴比妥钠,1000u/ml肝素化林格氏液,lpd液(low potassium dextran低钾右旋糖酐液)(自配)。呼吸机:dh-150型人工呼吸器(浙江大学医学仪器厂),滚压灌注泵:stocket-shiley ⅱ型 (stocket 德国),恒流泵:hl-1型(上海沪西仪器厂),套管针:14g、16g、18g、22g。

    1.2  供体手术  术前6 h禁食,自由饮水,称重记录。1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射,麻醉成功后仰卧固定于特制手术台上。经下肢周围静脉肝素化(1000u/kg体重),颈部纵行切口,气管切开,以14g套管针行气管插管,打结固定与呼吸机相连,潮气量5 ml,频率50次/min,吸呼比1∶2。剪开剑突,正中剪开胸骨,以自动撑开器撑开,打开心包及双侧胸膜,断开呼吸机,自气管插管处分离气管和食道至后纵隔,剪断主动脉弓及上腔静脉,在膈肌水平横断降主动脉和下腔静脉,取出心肺组织。同时助手用肝素注射器收集流入胸腔内的血液,每只鼠可收集10 ml左右,存于冰箱待用。即刻切开心脏右室流出道,插入肺动脉插管至肺动脉主干,并固定于灌注装置中,剪开左心耳及左心室以备肺动脉灌洗的引流。将4℃ lpd液30 ml(100 ml/kg)以30 cm的高度落差,经肺动脉灌注管灌洗大鼠肺,记录肺动脉灌洗压力和时间到灌洗结束。灌洗时继续保持通气,并检查有无肺损伤和漏气。在吸气末夹住气管,保持肺膨胀状态。将取下的心肺组织,浸没于装有4℃ lpd保护液的容器中,外层加盖湿纱布,塑料薄膜覆盖,恒温冰箱4℃保存12 h。整个过程应防止肺不张、损伤肺表面和压迫肺组织。从肺温缺血至心肺组织浸于低温保护液中,时间应在10 min之内。

    1.3  受体手术  取一只实验用大鼠,麻醉同上,以台灯照射保温。颈部纵行切口,气管切开,以14g套管针行气管插管。左侧腹股沟纵行剪开皮肤,暴露股动、静脉,严密止血,钝性游离股动、静脉。静脉推注肝素(1000u/kg体重)使转流鼠肝素化。股动脉下穿过1号丝线两根,结扎股动脉远心端,近心端丝线留置。股动脉以22g套管针穿刺,将套管针送过腹股沟韧带,以留置之1号丝线结扎固定,少量肝素盐水冲洗套管针。分离左侧颈内动脉,主干下套过两根1号丝线留置备用,以22g套管针穿刺,将套管针送入,以一根留置丝线结扎固定,另一根留置丝线结扎颈内动脉穿刺点之远心端。同样方法游离并用16g套管针穿刺右侧颈静脉,丝线固定。分别以4×12无创缝线将两根套管针与其下软组织缝扎固定,缝合皮肤以保持体温。

    1.4  离体再灌注  以新鲜肝素化大鼠(1000u/kg体重)血液10 ml预充管道,转机充分排气,检查管路确保通畅并连接紧密。取出保存后的心肺组织,悬置于有机玻璃恒温灌注箱内,用热循环水保持箱内湿度和温度(37℃~39℃)。给供体肺通氧气,设定潮气量5 ml,频率50次/min。通过重力作用,将转流大鼠颈静脉经管道引流入储血池,管道加装调节阀控制引流速度。通过肺动脉灌注管,将储血池中的静脉血经肺动脉插管泵入灌注供体肺。供体肺引流出的氧合血汇集于另一储血池,用泵以同样的速度,经股动脉回输给转流大鼠。依据大鼠颈动脉压可反映转流大鼠体液的出入量,通过调节回输速度来维持平衡,保持颈动脉压在80 mmhg以上。

    1.5  评价模型的指标  分别于再灌注开始后1 min、20 min、40 min和60 min取颈静脉流出血样1份及供体肺流出血一份,分别测定ph、po2、pco2和hb的变化情况。同时监测供体肺动脉压(pap)和供体肺气道压(pip)。

    1.6  统计学分析  应用spss10.0统计软件进行统计分析,所有数据以(±sd)表示。统计方法采用随机区组方差分析和组间t检验,p<0.05为有显著性差异。

    2  结  果

    2.1  再灌注过程中流入供体肺的血气分析  不同时段pvo2、pvco2、hb、ph水平相近,无明显波动,经检验各时段无明显统计学差异(p>0.05),可为供体肺提供稳定的静脉血,见表1。

    2.2  再灌注后流出供体肺的动脉血血气分析  pao2、paco2、pap、pip的变化结果可见随着灌注时间延长变化,除pao2逐渐降低外,其余各指标均逐渐升高。pao2和paco2在20 min后的各时段较20 min时有显著性差异(p<0.05或p<0.01),pap在60 min时与1 min时相比有显著性差异(p<0.05),pip在40 min后各时段与1 min时相比有显著性差异(p<0.05),见表1。

    3  讨  论

    在肺移植模型中,心肺联合移植、双肺移植、单肺移植模型由于操作复杂,实验条件要求高使其应用受到一定的限制[5]。小动物离体灌注模型具有简单、经济等优点,被广泛用于低温保存后的供体肺功能评价。这类模型的原理是用静脉血或合成介质来灌注离体肺,可以同时测定有关肺换气功能指标,肺循环阻力和肺顺应性,其中静脉化全血具有生理状态下的血气指标,用来灌注离体肺的效果优于晶体液,后者不能反映白细胞功能,且易导致肺水肿而在一定程度上影响实验结果[6]。而应用人工去氧装置将血液循环利用,虽然可以减少用血量,但由于表1  再灌注过程中流入供体肺的血液和流出供体肺的动脉血血气分析结果注:*与20 min时段相比,p<0.05;**与20 min时段相比,p<0.01;#与1 min时段相比,p<0.05

    毒性代谢产物的堆积改变了ph值和一些血液成分,难以模拟体内环境变化[7]。而应用膜肺成本高,血液经过膜肺,可激活炎性反应,对实验结果有一定影响[8]。

    本实验模型采用受体鼠颈静脉中引流出的静脉血灌注离体肺,流出的氧合血再经股动脉输回受体鼠体内以解毒、去氧,不会造成有毒代谢产物堆积,不需要人工去氧设备,可以最大程度地模仿正常生理状态。

    正常情况下,大鼠心输出量为47 ml/min左右,明显高于本实验中5 ml/min的转流量,因此本实验模型中受体大鼠可以稳定、可靠地将回输动脉血静脉化并通过肝脏代谢充分去毒。因sd大鼠为近交系大鼠,其基因序列基本相同,组织相容性较好,不会出现明显的组织排斥和溶血反应,本实验中确未见有明显的溶血现象发生。实验结果中pvo2、pco2、hb和ph均在统计学上无明显差异,说明此模型可以保证至少连续1 h提供稳定、合格的静脉血。

    本模型中氧合血经股动脉而非静脉回输,有以下优点:①可以减轻受体大鼠心脏负担,有利于保持血流动力学稳定;②静脉血氧分压不受影响而相对恒定;③离体肺或循环管道中产生的微栓颗粒会被受体大鼠的外周循环滤过,不会再进入受体大鼠心肺循环或离体肺循环中,进一步保持血流动力学稳定和防止供体肺功能指标受干扰。

    采用大鼠作为研究对象,动物来源丰富,检测抗体及各种试剂来源较多,解决了应用其他动物实验时抗体缺乏的问题

    本模型为离体灌注模型,与在体移植模型呼吸模式有所不同。在体移植模型胸腔为负压,肺脏的充气与排气由胸廓和膈肌情况影响;离体肺的充气过程则由呼吸机控制,更直接地反映肺顺应性等指标。在体移植肺血供来自心脏,近似生理状态,但各组间的肺灌注量多少不一致,也易受动物体液因素的影响;离体肺由机械泵供血,属非生理状态,但灌注流量易于控制,能够有效地控制流入肺动脉的血液成分、流量以及通气成分和潮气量,使流出血的分析更有可比性。本模型建立的操作要点:①供体肺摘取过程中,应暂时断开呼吸机通路,使肺萎陷,待灌洗时再接通呼吸机,这样可以避免操作过程中损伤肺脏。 ②整个实验过程中,应小心操作避免肺出血,操作过程中钳夹心脏进行操作,取出供体肺时可钳夹食管将肺游离提出;温缺血时间应在10 min以内避免影响实验结果。③受体大鼠操作中应注意保温和严密止血,防止低温和失血影响循环,建立循环过程应在20 min左右;④再灌注过程中,除给供体大鼠输注同源新鲜血和少量5% nahco3外,不应加用其它心血管药物,通过调节阀控制静脉引流量,依据颈动脉压决定补液量,维持血压平稳。⑤再灌注时随时注意颈静脉的引流情况,套管针深度适中,太浅易脱落或引流不畅,太深易导致心率失常。引流出体外的血液最好也用热交换器保持温度。

    该模型应用范围广泛,在供体肺保存方面可进行灌洗前用药、保存液成份、保存温度、充气成份或状态、再灌注阶段代谢变化,白细胞功能以及组织学改变等诸多种研究。同时所需实验经费少,出结果快,并可同期进行多组实验。因此,在对比研究和确定研究方向等方面,大鼠离体肺连续再灌注模型,是一种较实用的实验动物模型。

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