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老年性痴呆大鼠M型乙酰胆碱受体功能变化的研究


□ 张百权 王伟 李传翔 聂辉

摘 要:

目的:探讨老年性痴呆大鼠M型乙酰胆碱受体功能变化。方珐:建立老年性痴呆(Alzheimer’s disease,AD)大鼠模型,抽提AD大鼠脑半球基底团多聚腺嘌呤mRNA,注射到非洲爪蟾卵母细胞上表达有功能的大鼠脑乙酰胆碱受体,利用电压钳技术记录电压依赖性的离子通道电流。比较AD大鼠组与正常对照组乙酰胆碱(ACh)引起的M型乙酰胆碱受体电流变化。结果:①AD组和对照组每克脑组织提取的poly(A)+mRNA分别为(18±6.2)ug,(19±5.8)ug,两者无统计学差异;②Cl^-是表达的M型ACh电流的主要载流离子;③注射老年大鼠海马组织mRNA后,ACh诱发的电流幅度(8.12±2.21)nA下降,比对照组(21.32nA)约下降(37±2.77)%,差异有极显著性(P<0.001)。结论:AD大鼠M型乙酰胆碱受体功能呈减弱趋势,其原因可能是受体蛋白遗传信息发生了改变。

作者单位:郧阳医学院附属东风公司总医院神经内科,湖北十堰 442008

【摘要】  目的:探讨老年性痴呆大鼠m型乙酰胆碱受体功能变化。方法:建立老年性痴呆(alzheimer’s disease, ad)大鼠模型,抽提ad大鼠脑半球基底团多聚腺嘌呤mrna,注射到非洲爪蟾卵母细胞上表达有功能的大鼠脑乙酰胆碱受体,利用电压钳技术记录电压依赖性的离子通道电流。比较ad大鼠组与正常对照组乙酰胆碱(ach)引起的m型乙酰胆碱受体电流变化。结果:①ad组和对照组每克脑组织提取的poly(a) + mrna分别为(18±6.2) μg,(19±5.8) μg,两者无统计学差异;②cl-是表达的m型ach电流的主要载流离子;③注射老年大鼠海马组织mrna后,ach诱发的电流幅度(8.12±2.21) na下降,比对照组(21.32 na)约下降(37±2.77)%,差异有极显著性(p<0.001)。结论:ad大鼠m型乙酰胆碱受体功能呈减弱趋势,其原因可能是受体蛋白遗传信息发生了改变。

【关键词】  老年性痴呆


    the alteration of m-type acetylcholine receptors’function in the rat with alzheimer’s diseasezhang bai-quan,wang wei,li chuan-xiang,et al. (department of neurology,dongfeng hospital, yunyang medical college,shiyan, hubei 442008,china)

    abstract: objective to investigate the alteration of rat's m-type acetylcholine receptors' function in the rat with alzheimer's disease. methods the model of the rat with alzheimer's disease was established. poly(a)+mrna was isolated from hippocampus of the rat's brain and was microinjected into hippocampus to express functional ion channels. voltage clamp technique was used to record the current of the voltage-dependent ion channels. the alterations of ach-inducing current were compared between the rat with alzheimer’s disease and the controlled group.results ①the poly(a) mrna isolated from hippocampus of the rat’s brain with alzheimer’s disease andthe controlled group were (18±6.2) μg, (19±5.8) μg,respectively (p>0.05).②the reversal potential of current induced by ach was about -20mv, indicating that cl- was the main carrier ion of current induced by ach.③the current amplitude induced by ach in oocytes injected with mrna isolated from the rat with alzheimer’s disease brain and the controlled group were (8.12 2.21 na),(21.32 na),respectively(p<0.001).conclusions the functions of m-type acetylcholine receptors in the rat with alzheimer's disease were reduced. the deficiency of expression of receptor in the rat with alzheimer's disease probably accounts for the reduction of current induced by ach.

    key words:the alzheimer’s disease; patch-clamp techniques ; function, receptors, cholinergic

   老年性痴呆(alzheimer’s disease, ad)病是一种以进行性认知障碍和记忆能力损害为主的中枢神经系统的退行性疾病。随着世界老龄化现象的日益严重,ad越来越严重地危害着人们的身体健康。ad的神经病理学基础还不十分明确[1],ad患者海马和新皮层胆碱乙酰转移酶(chat)及乙酰胆碱(ach)显著减少,目前认为是由于大脑半球海马及其皮层纤维突触前胆碱能神经元变性,使ach缺乏所致[2],但对突触后膜m型乙酰胆碱受体可塑性及功能变化的研究较少。

    作者采用将抽提的ad大鼠海马组织多聚腺嘌呤mrna(poly a mrna)注射到非洲爪蟾卵母细胞上表达有功能的大鼠脑乙酰胆碱受体(m-achr)的实验模型来研究ad大鼠m型乙酰胆碱受体功能变化。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物1.5~2年,体重200~250 g的成熟雌性爪蟾(xenopus laevis)3只由中国科学院遗传与发育研究所提供。wistar大鼠由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供。

    1.2  实验器材 大鼠肌肉组织mrna提取采用美国promega公司的新磁珠技术(polya ttract 1000系统),胶原酶i、乙酰胆碱(ach)、焦磷酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate, dep )、hepes为sigma公司产品,其它试剂为国产分析纯。微注射仪由world precision instruments公司生产;电压钳放大器为oc-725c型卵母细胞双电极电压钳仪(美国warner公司);记录仪为华中科技大学仪博公司提供的数据釆取与分析系统(cytobench系统);玻璃电极拉制仪为德国heak;脑立体定位仪上(sr-6型,日本);喹啉酸(qa,sigma产品);二苯羟乙酸奎宁酯(qnb,解放军军事医学科学院提供);体视显微镜,小型真空泵,冷光源,电屏蔽箱,浴槽,灌流装置等。

    1.3  实验动物模型制备实验组给予 d-半乳糖 50 mg·kg-1·d-1,连续6周皮下注射,造成亚急性衰老模型。然后将喹啉酸注入亚急性衰老大鼠海马,通过qa的神经毒性作用,造成 ad大鼠模型。具体方法:采用面罩式吸入麻醉(1.5%安氟醚和30%氧气),将大鼠头部固定在脑立体定位仪上,沿中线切开头皮暴露颅骨,参照 rosenberg等方法[3],取坐标(a0.2,l2.5,h7.5mm),牙钻钻孔,以微量注射器垂直进针,将0.01 ml/lph 7.4的pbs缓冲液溶解的qa 1 μl(含qa 75 nmol/ml)缓慢注入两侧海马,每侧注入时间为 5 min,留针时间 5 min。局部消毒后,缝合皮肤。术中维持肛温(36.6±0.5)℃。

    1.4  卵母细胞的采取 爪蟾冰浴麻醉(约30 min),剪下2~3个卵叶,置于盛有nd96培养液的表面皿中。分离出单个卵母细胞,置于无钙nd96培养液中,部分用胶原酶ⅰ消化1~2 h(2 mg/ml),以去除卵巢膜和滤泡膜。挑选成熟的卵母细胞(ⅴ~ⅵ期)于nd96培养液中,19 ℃恒温恢复数小时。

    1.5  大鼠脑半球基底团mrna的制备 将注射qa 20 d后的大鼠用3%的戊巴比妥钠 30 mg/kg经腹腔麻醉后,断头取脑,迅速剥离双侧海马组织,用预冷水洗涤2次,经匀浆、探针退火、rna的洗脱和冻干等过程分离得到poly(a)+mrna,置-70 ℃备用。对照组也依此方法取出mrna。

    1.6  微量注射通过微量注射仪将提取的mrna(1 ng/nl)在去膜卵母细胞动物极于每个卵母细胞注射50~100 nl,注射后的卵母细胞在nd96培养液中温浴2~3 d,每天换液并去除坏死细胞,最后选用32个作为实验对象。

    1.7  电生理记录实验采用常规的双电极电压钳记录方法。电压电极用0.15 mol/l kcl,电流电极用3 mol/l kcl灌注,入水后电压电极阻抗约为1~10 mω,电流电极的阻抗为0.1~1 mω,钳制电压为-60 mv。实验中以ringer’s液灌流,灌流速度为3~5 ml/min,调整蠕动泵的速度,保持液面恒定且无液体外流。试验药物均用ringer’s液稀释。给药前通过三通完全阻断灌流,给药后充分灌流10 min,每次给药量为2.5 ml。实验温度控制在(19±1) ℃;实验电流变化由cytobench记录并分析。

    1.8  统计学方法数据比较采用不配对t检验或tukey’s检验中的单因素变异分析,p<0.05认为有统计学差异。

    2  结果

    2.1  大脑海马组织poly(a)+mrna的提取从大鼠海马组织中提取poly(a)+mrna经紫外分光光度计检测a260/a280比值为1.9,说明蛋白质己基本去除干净,提取的mrna纯度较好。ad组和对照组每克脑组织提取的poly(a)+mrna分别为 (18±6.2) μg,(19±5.8) μg,两者无统计学差异。

    2. 2  卵母细胞的静息电位实验从3只爪蟾取卵,共检测32个细胞,静息膜电位(rp)变动范围在-10~-52 mv之间。为了确保实验结果的稳定性和可靠性,本实验选择静息电位大于-20 mv的卵母细胞进行电压钳实验。

    2.3  乙酰胆碱诱导的电流反应卵母细胞具有天然ach m样受体电流反应,为了检测移植到卵母细胞上的ach受体电流反应,实验用高效、专一的m受体拮抗剂qnb0.1 mmol/l处理卵母细胞30 min,抑制天然的m型ach受体的电流反应,注射脑mrna后检测到的膜电流即为表达后的受体反应。ach电流反应波型为一内向电流。将膜电位分级钳位在-100~+20 mv,步幅为20 mv,分别记录不同钳位水平的膜电流,构成电流-电位关系曲线(见图1)。从图1中可以看出,随着膜电位向正方向偏移,电流幅度逐渐减小,大约在-22 mv,电流幅度为0。当膜电位继续向正方向变化,电流方向发生改变,即由内向性电流转变为外向性电流。对膜电位为-80~-2 mv时的内向电流进行直线回归分析表明,膜电位与内向电流之间存在线性关系,相关系数为0.989,直线回归方程为y=-15.2-0.89x,直线与水平电压轴交点为-17.12 mv,此点即为m型ach电流的逆转电位,该值接近卵母细胞的cl-平衡电位,初步推测cl-是表达的m型ach电流的主要载流离子。为了进一步证实上述结论,实验用so42-取代细胞外液50%cl-,观察细胞外液cl-浓度对表达的ach m样受体电流的影响。图1表明,细胞外液cl-浓度减半,钳制电位为-60 mv时,10-6mol/l ach诱导的电流幅度下降47.39%,逆转电位变化幅度为(16±1) mv。进一步表明cl-是表达m型ach受体电流的主要载流离子。

    注射老年大鼠海马组织mrna后,ach诱发的电流幅度下降(8.12±2.21) na,比对照组(21.32 na)约下降(37±2.77)%,差异有极显著性(p<0.001)。

    3  讨论

  ad动物模型的研究阐明药物的作用机制,从而为更好地指导临床提供了基础。ad模型制作主要有以下几个方面[4]:模拟行为、记忆方面的改变采用电解损毁、手术切断、注入兴奋性神经毒性物质、胆碱能神经元所致自身免疫造成胆碱能损伤模型。近年来ad的研究重点转移到β-淀粉样蛋白和转基因动物的分子生物学研究。本课题采用的模型是在 d-半乳糖导致大鼠亚急性中毒而致早衰的基础上,再用兴奋性氨基酸受体激动剂qa海马内注射,破坏海马胆碱能神经元,造成类 ad改变。这种模型是结合 ad发病的老化特点及有关的神经生化改变而研制的,是目前可取的ad模型之一。

    本实验检测了ad模型大鼠m型乙酰胆碱受体的功能变化。注射ad模型大鼠海马组织mrna后,卵母细胞对ach的电流反应显著下降,提示受体功能下降,可能与ach失敏有关。失敏是生物界的普遍现象,在生理及病理状态下,失敏在控制受体介导信号传导过程中有其重要作用[5]。磷酸化是受体翻译后共价修饰的重要过程,是受体经多种激酶调节及受体失敏的共同机制。ach受体与配基结合,使受体的构象改变,从而成为某些激酶或磷酸酯酶作用的底物。磷酸化作用可能仅调节失敏,并不引发失敏。老化受体失敏的具体原因目前还不清楚[6],但目前认为受体蛋白合成翻译水平的改变起着重要的作用,所以我们认为ad的发生中除了ach的缺乏外,病变的受体对ach的失敏感也可能参与了ad的发病过程。

    本实验从大鼠海马组织中提取mrna注入爪蟾卵母细胞中,由其翻译系统将mrna转译成蛋白质镶嵌在细胞膜上形成受体。从成年和老年大鼠海马组织提取的mrna的纯度和量、卵母细胞的大小及微量注射的浓度和量都实行定量观察,实验结果表明ad老年大鼠海马组织mrna表达的递质受体反应较成年鼠明显减低,提示老年大鼠脑递质受体反应性降低可能源于受体蛋白遗传信息发生了改变。由此可以推论老年大鼠除了脑神经元丢失外,神经递质受体蛋白合成翻译水平也发生了改变。

【参考文献】 ......(未完,请点击下方“在线阅读”)

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